Hotstart Taq DNA-polymerase
Hot Start Taq DNA-polymerase (antilichaammodificatie) is een hot-start thermostabiel DNA-polymerase van Thermus Aquaticus YT-1, dat een 5' → 3'-polymerase-activiteit en een 5'-flap-endonuclease-activiteit bezit.Het hot-start Taq DNA-polymerase is een Taq DNA-polymerase dat gemodificeerd is door thermolabiele Taq-antilichamen.Antilichaammodificatie verhoogde de specificiteit, gevoeligheid en opbrengst van PCR.
Componenten
| Onderdeel | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×HC Taq-buffer | 4×1 ml | 4×10 ml | 4×50 ml | 5×400 ml |
| Hot Start Taq DNA-polymerase (gemodificeerd antilichaam) (5 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 10×5 ml |
Toepassingen
10 mM Tris-HCl (pH 7,4 bij 25 ℃), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 0,5% Tween20, 0,5% IGEPALCA-630 en 50% glycerol.
Opslag condities
Transport onder 0°C en opgeslagen bij -25°C~-15°C.
Eenheidsdefinitie
Eén eenheid wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die 15 nmol dNTP in 30 minuten bij 75°C in zuuronoplosbaar materiaal opneemt.
Kwaliteitscontrole
1.Endonuclease-activiteit:Incubatie van 20 U enzym met 4 μg pUC19 DNA gedurende 4 uur bij 37°C resulteerde in geen detecteerbare afbraak van het DNA, zoals bepaald door gelelektroforese.
2.5 kb Lambda-PCR:25 cycli PCR-amplificatie van 5 ng Lambda-DNA met 1,25 eenheden Taq DNA-polymerase in aanwezigheid van 200 µM dNTP's en 0,2 µM primers resulteren in het verwachte product van 5 kb.
3.Exonuclease-activiteit:Incubatie van een reactie van 50 µl die minimaal 12,5 U Taq DNA-polymerase bevat met 10 nmol 5'-FAM-oligonucleotide gedurende 30 minuten bij 37°C levert geen detecteerbare afbraak op.
4.RNase-activiteit:Incubatie van 10 µl reactie die 20 U enzym bevatte met 1 µg RNA-transcripten gedurende 2 uur bij 37°C resulteerde in geen detecteerbare afbraak van het RNA, zoals bepaald door gelelektroforese.
5.Warmte-inactivatie:Nee.
Reactiesysteem
| Componenten | Volume |
| Sjabloon-DNAa | optioneel |
| 10 μM voorwaartse primer | 0,5 μl |
| 10 μM omgekeerde primer | 0,5 μl |
| dNTP-mix (elk 10 mM) | 0,5 μl |
| 5×HC Taq-buffer | 5 μl |
| Taq DNA-polymeraseB(5U/μL) | 0,125 μl |
| Nucleasevrij water | Tot 25 μl |
Opmerkingen:
1) een.
| DNA | Hoeveelheid |
| Genomisch | 1 ng-1 μg |
| Plasmide of viraal | 1 pg-1 ng |
2) b.De optimale concentratie van Taq DNA-polymerase kan variëren van 5-50 eenheden/ml (0,1-0,5 eenheden/25 µl reactie) in gespecialiseerde toepassingen.
Thermisch cyclusprotocol
PCR
| Stap | Temperatuur(°C) | Tijd | Cycli |
| Initiële denaturatiea | 95 ℃ | 1-3 minuten | - |
| Denaturatie | 95 ℃ | 15-30 sec | 30-35 cycli |
| GloeienB | 45-68 ℃ | 15-60 sec | |
| Verlenging | 68 ℃ | 1 kb/min | |
| Laatste verlenging | 68 ℃ | 5 mins | - |
Opmerkingen:
1) Een initiële denaturatie van 1 minuut bij 95°C is voldoende voor de meeste amplificaties.Voor moeilijke templates wordt een langere denaturatie van 2-3 minuten bij 95°C aanbevolen.Bij kolonie-PCR wordt een initiële denaturatie van 5 minuten bij 95°C aanbevolen.
2) De uitgloeistap duurt doorgaans 15-60 s.De gloeitemperatuur is gebaseerd op de Tm van het primerpaar en bedraagt doorgaans 45-68 ℃.
