Kit voor muisgenotypering
Katnummer: HCR2021A
Dit product is een kit ontworpen voor de snelle identificatie van muisgenotypes, inclusief ruw DNA-extractie- en PCR-amplificatiesysteem.Het product kan worden gebruikt voor PCR-amplificatie rechtstreeks uit muisstaart-, oor-, teen- en andere weefsels na eenvoudige splitsing door Lysis Buffer en Proteinase k.Geen nachtelijke ontsluiting, fenol-chloroformextractie of kolomzuivering, wat eenvoudig is en de tijdrovende experimenten verkort.Het product is geschikt voor amplificatie van doelfragmenten tot 2 kb en multiplex PCR-reacties met maximaal 3 paar primers.De 2×Mouse Tissue Direct PCR Mix bevat genetisch gemanipuleerde DNA-polymerase, Mg2+, dNTP's en een geoptimaliseerd buffersysteem om een hoge amplificatie-efficiëntie en remmertolerantie te bieden, zodat PCR-reacties kunnen worden uitgevoerd door template en primers toe te voegen en het product te rehydrateren tot 1×.Het met dit product geamplificeerde PCR-product heeft een prominente “A”-base aan het 3’-uiteinde en kan na zuivering direct worden gebruikt voor TA-klonering.
Componenten
| Onderdeel | Maat |
| 2×muisweefsel directe PCR-mix | 5×1,0 ml |
| Lysisbuffer | 2×20 ml |
| Proteïnase K | 800 μl |
Opslag condities
Producten moeten gedurende 2 jaar bij -25~-15℃ worden bewaard.Na het ontdooien kan de Lysis Buffer bij 2~8℃ worden bewaard voor meervoudig gebruik op korte termijn, en goed mengen tijdens gebruik.
Sollicitatie
Dit product is geschikt voor muizen-knockout-analyse, transgene detectie, genotypering enzovoort.
Functies
1.Eenvoudige bediening: geen noodzaak om genomisch DNA te extraheren;
2.Brede toepassing: geschikt voor directe amplificatie van diverse muizenweefsels.
Instructies
1.Vrijgave van genomisch DNA
1) Bereiding van lysaat
Weefsellysaat wordt bereid op basis van het aantal te lyseren muizenmonsters (weefsellysaat moet ter plaatse worden bereid volgens de dosering en grondig worden gemengd voor gebruik), en het aandeel reagentia dat nodig is voor een enkel monster is als volgt:
| Componenten | Volume (μl) |
| Proteïnase K | 4 |
| Lysisbuffer | 200 |
2) Monstervoorbereiding en lysis
Aanbevolen weefselgebruik
| Soort vanZakdoek | Aanbevolen volume |
| Muis staart | 1-3 mm |
| Muis oor | 2-5 mm |
| Muis teen | 1-2 stuks |
Neem een geschikte hoeveelheid muizenweefselmonsters in schone centrifugebuizen, voeg 200 μl vers weefsellysaat toe aan elke centrifugebuis, vortex en schud, incubeer vervolgens gedurende 30 minuten bij 55 ℃ en verwarm vervolgens gedurende 3 minuten bij 98 ℃.
3) Centrifugatie
Schud het lysaat goed en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 12.000 rpm.Het supernatant kan worden gebruikt als sjabloon voor PCR-amplificatie.Als de sjabloon nodig is voor opslag, breng het supernatant dan over naar een andere steriele centrifugebuis en bewaar deze gedurende 2 weken bij -20 ℃.
2.PCR-amplificatie
Verwijder de 2×Mouse Tissue Direct PCR Mix van -20℃ en ontdooi op ijs, meng ondersteboven en bereid het PCR-reactiesysteem voor volgens de volgende tabel (bedienen op ijs):
| Componenten | 25μlSysteem | 50μlSysteem | Laatste concentratie |
| 2×muisweefsel directe PCR-mix | 12,5 μl | 25μl | 1× |
| Primer 1 (10 μM) | 1,0 μl | 2,0 μl | 0,4 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 1,0 μl | 2,0 μl | 0,4 μM |
| Splijtproducta | Zoals vereist | Zoals vereist |
|
| ddH2O | Tot 25 μl | Tot 50 μl |
|
Opmerking:
a) De toegevoegde hoeveelheid mag niet groter zijn dan 1/10 van het systeem, en als er te veel wordt toegevoegd, kan de PCR-amplificatie worden geremd.
Aanbevolen PCR-omstandigheden
| Cyclus stap | Temp. | Tijd | Cycli |
| Initiële denaturatie | 94℃ | 5 mins | 1 |
| Denaturatie | 94℃ | 30sec | 35-40 |
| Gloeiena | Tm+3~5℃ | 30sec | |
| Verlenging | 72℃ | 30 sec/kb | |
| Laatste verlenging | 72℃ | 5 mins | 1 |
| - | 4℃ | Uitstel | - |
Opmerking:
a) Uitgloeitemperatuur: Met betrekking tot de Tm-waarde van de primer wordt aanbevolen om de uitgloeitemperatuur in te stellen op de kleinere Tm-waarde van de primer +3~5℃.
Veelvoorkomende problemen en oplossingen
1.Geen gerichte strips
1) Overmatig lysisproduct.Kies de meest geschikte hoeveelheid sjabloon, meestal niet meer dan 1/10 van het systeem;
2) Te grote steekproefomvang.Verdun het lysaat 10 keer en amplificeer vervolgens, of verklein de monstergrootte en herlyse;
3) Weefselmonsters zijn niet vers.Het wordt aanbevolen om verse weefselmonsters te gebruiken;
4) Slechte primerkwaliteit.Gebruik genomisch DNA voor amplificatie om de primerkwaliteit te verifiëren en het primerontwerp te optimaliseren.
2.Niet-specifieke amplificatie
1) De gloeitemperatuur is te laag en het cyclusnummer is te hoog.Verhoog de gloeitemperatuur en verminder het aantal cycli;
2) De sjabloonconcentratie is te hoog.Verminder de hoeveelheid template of verdun de template 10 keer na amplificatie;
3) Slechte primerspecificiteit.Optimaliseer het primerontwerp.
Opmerkingen
1.Om kruisbesmetting tussen monsters te voorkomen, moeten meerdere bemonsteringsinstrumenten worden voorbereid en kan het oppervlak van de instrumenten na elke bemonstering worden gereinigd met 2% natriumhypochlorietoplossing of nucleïnezuurreiniger als herhaald gebruik vereist is.
2.Het wordt aanbevolen om vers muizenweefsel te gebruiken en het bemonsteringsvolume mag niet te groot zijn om te voorkomen dat de amplificatieresultaten worden beïnvloed.
3.Lysisbuffer moet veelvuldig bevriezen en ontdooien vermijden en kan worden bewaard bij 2 ~ 8 ℃ voor meervoudig gebruik op korte termijn.Bij opslag bij lage temperaturen kan er neerslag optreden en dit moet vóór gebruik volledig worden opgelost.
4.PCR Mix moet veelvuldig invriezen en ontdooien vermijden en kan bij 4 ℃ worden bewaard voor herhaald gebruik op korte termijn.
5.Dit product is alleen bedoeld voor wetenschappelijk experimenteel onderzoek en mag niet worden gebruikt bij klinische diagnose of behandeling.
