Snelle Ampli RT-qPCR Premix plus-UNG
Katnummer: HCB5144E
Fast Ampli RT-qPCR Premix plus-UNG is speciaal ontwikkeld voor lyofilisatieprocessen, toegepast voor fluorescentiekwantificering (TaqMan-sonde) RNA-amplificatiedetectie met neocript reverse transcriptase en snelle amplificatie DNA-polymerase verkregen door genetisch gemodificeerd en screening die de PCR-amplificatie binnen 20 minuten kan voltooien -40 minuten.Dit reagens heeft een hoge remmertolerantie, die een hogere efficiëntie van reverse transcriptie en PCR-amplificatie heeft, geschikt voor hooggevoelige amplificatie van RNA-monsters met een lage concentratie.Binnen een breed kwantitatief bereik kan een goede standaardcurve worden verkregen, en de kwantificering kan nauwkeurig worden uitgevoerd.Dit reagens maakt gebruik van een gemengd enzym van anti-remmingsamplificatie-enzym en UNG-enzym, evenals een geoptimaliseerd buffersysteem dat dUTP bevat.Het kan niet alleen een goede amplificatie van het doelgen bereiken in monsters die remmers bevatten, maar ook effectief vals-positieve amplificatie voorkomen die wordt veroorzaakt door PCR-resten en aerosolvervuiling.Dit reagens is compatibel met de meeste fluorescerende kwantitatieve PCR-instrumenten, zoals Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche enzovoort.Dit reagens kan worden gebruikt voor lyofilisatie om een goede gelyofiliseerde vorm en productstabiliteit te verkrijgen.
Samenstelling reagens
1. 12,5×FastAmpli Part Taq/UNG Mix (met dNTP's) (DG)
2. 50× FastAmpli Part RTase (DG)
3. 5 × FastAmpliRT-buffer (DG)
4. 4 × lyoprotectant (optioneel) (DG)
Opslag condities
Kan langdurig worden bewaard bij -20℃ en maximaal 3 maanden bij 4℃.Goed mengen voor gebruik en vermijdenfrequent invriezen en ontdooien.
Fietsprotocol
|
Stap |
Temperatuur | Reguliere PCR Procedure | Snelle PCRProcedure |
Cycli |
| Duur | Duur | |||
| AchteruitTranscriptie | 50℃ | 15 minuten | 5 minuten | uitstel |
| PolymeraseActivering | 95℃ | 1-5 minuten | 1-2 minuten | uitstel |
| Denatureren | 95℃ | 10-20 sec | 1-3 sec | 40-50 |
| Gloeien/verlenging | 56-64℃ | 20-60 sec | 3-20 sec |
RT-qPCR Vloeistofreactieion-systeem
| Samenstelling | 25 µl Volume | 50 µl Volume | Concentratie |
| 5×FastAmpli RT-buffer | 5 µl | 10 µl | 1× |
| 12,5×FastAmpli Onderdeel Taq/UNG Mix (met dNTP's) | 2 µl | 4 µl | 1× |
| 50× FastAmpli-onderdeel RTase | 0,5 µl | 1 µl | 1× |
| 4×lyoprotectant | 6,25 µl | 12,5 µl | 1× |
| 25×Primer-Probe-mix | 1 µl | 2 µl | 1× |
| Sjabloon-RNA | — | — | — |
| ddH2O | Tot 25 µl | Tot 50 µl | 1× |
1. Dit systeem is een lyofilisatiesysteem;Wanneer klanten dit systeem gebruiken zonder lyofilisatievereisten, kan 4×lyoprotectant selectief worden toegevoegd;Als er gelyofiliseerde producten nodig zijn, moet tijdens de validatie van de productprestaties van de vloeibare reagentia 4×lyoprotectant worden toegevoegd om consistentie met de gelyofiliseerde systeemcomponenten en effecten te garanderen.
2. Bij gebruik van de reguliere PCR-procedure is de uiteindelijke concentratie van de primer gewoonlijk 0,2 μM.Voor betere resultaten kan de primerconcentratie worden geoptimaliseerd binnen het bereik van 0,2-1,0 μM.De sondeconcentratie kan worden geoptimaliseerd binnen het bereik van 0,1-0,3 μM.Concentratiegradiëntexperimenten kunnen worden uitgevoerd om de beste combinatie van primers en probes te vinden.
3. Bij gebruik van de snelle PCR-amplificatiemethode kan een beter resultaat worden bereikt door de primer/probe-concentratie te verhogen en door het percentage primer en probe aan te passen.
4. Verschillende soorten templates bevatten een verschillend aantal kopieën van het doelgen.Indien nodig kan een gradiëntverdunning worden uitgevoerd om de juiste optimale hoeveelheid templatetoevoeging te selecteren.
Voorbereiding van het lyofilisatiesysteem
| Samenstelling | 25 µl reactie Systeem |
| 5×FastAmpli RT-buffer | 5 µl |
| 12,5×FastAmpli Part Taq/UNG Mix (met dNTP's) (DG) | 2 µl |
| 50×FastAmpli-onderdeel RTase (DG) | 0,5 µl |
| 4×Lyoprotectant | 6,25 µl |
| 25×Primer-Probe-mix | 1 µl |
| ddH2O | Tot 18~20 µl |
*Als andere systemen voor lyofilisatie nodig zijn, raadpleeg dan afzonderlijk.
Lyofilisatie Process
| Procedure | Temp. | Tijd | Voorwaarde | Druk |
| Bevriezing | 4℃ | 30 minuten | Uitstel | 1 atm |
| -50℃ | 60 min | Koeling | ||
| -50℃ | 180 min | Uitstel | ||
| Primaire droging | -30℃ | 60 min | Verwarming | Ultiem vacuüm |
| -30℃ | 720 min | Uitstel | ||
| Secundair drogen | 25℃ | 60 min | Verwarming | Ultiem vacuüm |
| 25℃ | 300 min | Uitstel |
1. Dit lyofilisatieproces is een in-situ vriesdroogproces voor een reactiesysteem van 25 µl;Als vriesdroogparels of andere in-situ vriesdroogprocessen vereist zijn, kunt u dit afzonderlijk aanvragen.
2. Het bovenstaande lyofilisatieproces is alleen ter referentie.Verschillende producttypes en verschillende vriesdrogers hebben verschillende parameters, zodat tijdens gebruik aanpassingen kunnen worden gedaan op basis van de werkelijke omstandigheden.
3. Verschillende lyofilisatieprocessen kunnen geschikt zijn voor gelyofiliseerde producten met verschillende batchgroottes, dus er moet voldoende testvalidatie worden uitgevoerd bij gebruik voor grootschalige productie.
Instructies voor het gebruik van lyophilized poeder
1. Centrifugeer het gevriesdroogde poeder kort;
2. Voeg het nucleïnezuursjabloon toe aan het gelyofiliseerde poeder en voeg water toe tot 25 µl;
3. Goed mengen door centrifugeren en op de machine laten draaien.
Kwaliteitscontrole
1. Functioneel testen: gevoeligheid, specificiteit, reproduceerbaarheid van RT-qPCR.
2. Geen exogene nucleaseactiviteit, geen exogene endo/exonucleaseverontreiniging.
Technische informatie:
1. De amplificatiesnelheid van snelle DNA-polymerase bedraagt maar liefst 1 kb/10s.Verschillende PCR-instrumenten hebben verschillende verwarmings- en koelsnelheden, temperatuurcontrolemodi en thermische geleidbaarheid, dus optimalisatie van uw primer/probe-concentratie en loopmethode in combinatie met uw specifieke snelle PCR-instrument is essentieel.
2. De omgekeerde transcriptietijd wordt geoptimaliseerd afhankelijk van de lengte van het te amplificeren fragment.Voor langere fragmenten kan de omgekeerde transcriptietijd op passende wijze worden verlengd.
3. De uitgloei-extensietemperatuur moet worden geoptimaliseerd op basis van de Tm-waarde van de primersonde en de feitelijke omstandigheden van de reactie.
4. Voor primers met een lagere uitgloeitemperatuur of fragmenten met een lengte van meer dan 200 bp wordt de driestapsmethode aanbevolen.
5. Gebruik speciale gebieden en pipetten voor en na de amplificatie, draag handschoenen en vervang deze regelmatig;Open de reageerbuis niet nadat de PCR-reactie is voltooid om besmetting van monsters door PCR-producten tot een minimum te beperken.
6. De gebruiksefficiëntie van dUTP en de gevoeligheid voor het UNG-enzym verschillen voor verschillende doelgenen. Als het gebruik van het UNG-systeem dus leidt tot een afname van de detectiegevoeligheid, moet het reactiesysteem worden aangepast en geoptimaliseerd.Als er technische ondersteuning nodig is, neem dan contact met ons op.
