Proteïnase K mNGS (vloeistof)
Proteinase K is een stabiel serineprotease met brede substraatspecificiteit.Het breekt veel eiwitten in de oorspronkelijke staat af, zelfs in de aanwezigheid van detergentia.Bewijs uit kristal- en moleculaire structuurstudies geeft aan dat het enzym behoort tot de subtilisinefamilie met een katalytische triade op de actieve plaats (Asp39-Zijn69-Ser224).De belangrijkste splitsingsplaats is de peptidebinding grenzend aan de carboxylgroep van alifatische en aromatische aminozuren met geblokkeerde alfa-aminogroepen.Het wordt vaak gebruikt vanwege zijn brede specificiteit.Dit proteïnase K is speciaal ontworpen voor mNGS.Vergeleken met de andere proteïnase K bevat het zelfs nog minder nucleïnezuurverontreiniging met dezelfde enzymatische prestaties, wat de stroomafwaartse mNGS-toepassing beter zou kunnen garanderen.
Opslag condities
2-8℃ gedurende 2 jaar
Specificatie
| Verschijning | Kleurloze tot lichtbruine vloeistof |
| Activiteit | ≥800 E/ml |
| Eiwitconcentratie | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Geen gedetecteerd |
| DNAse | Geen gedetecteerd |
| RNase | Geen gedetecteerd |
Eigenschappen
| EG-nummer | 3.4.21.64(Recombinant van Tritirachium-album) |
| ISO-elektrisch punt | 7.81 |
| Optimale pH-waarde | 7.0- 12.0 Afb. 1 |
| Optimale temperatuur | 65 ℃ Afb. 2 |
| pH-stabiliteit | pH 4,5- 12,5 (25 ℃, 16 uur) Afb. 3 |
| Thermische stabiliteit | Onder 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Afb. 4 |
| Opslag stabiliteit | Meer dan 90% activiteit gedurende 12 maanden bij 25 ℃ |
| activatoren | SDS, ureum |
| remmers | Diisopropylfluorfosfaat;fenylmethylsulfonylfluoride |
Toepassingen
1. Kit voor genetische diagnose
2. RNA- en DNA-extractiekits
3. Extractie van niet-eiwitcomponenten uit weefsels, afbraak van eiwitonzuiverheden, zoals DNAvaccins en bereiding van heparine
4. Bereiding van chromosoom-DNA door gepulseerde elektroforese
5. Westernvlek
6. Enzymatische geglycosyleerde albumine-reagentia in vitro-diagnose
Voorzorgsmaatregelen
Draag bij gebruik of wegen beschermende handschoenen en een veiligheidsbril en zorg voor een goede ventilatie na gebruik.Dit product kan een huidallergische reactie en ernstige oogirritatie veroorzaken.Bij inademing kan het allergische of astmasymptomen of kortademigheid veroorzaken.Kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken.
Eenheidsdefinitie
Eén eenheid (U) wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om caseïne te hydrolyseren om 1 μmol te producerentyrosine per minuut onder de volgende omstandigheden.
Bereiding van reagentia
Reagens I: 1 g melkcaseïne werd opgelost in 50 ml 0,1 M natriumfosfaatoplossing (pH 8,0), gedurende 15 minuten geïncubeerd in 65-70 ℃ water, geroerd en opgelost, gekoeld met water, aangepast met natriumhydroxide tot pH 8,0 en een vast volume 100 ml.
Reagens II: 0,1 M trichloorazijnzuur, 0,2 M natriumacetaat, 0,3 M azijnzuur.
Reagens III: 0,4M Na2CO3oplossing.
Reagens IV: Forint-reagens 5 keer verdund met zuiver water.
Reagens V: Enzymverdunningsmiddel: 0,1 M natriumfosfaatoplossing (pH 8,0).
Reagens VI: tyrosineoplossing: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tyrosine opgelost met 0,2M HCl.
Procedure
1. 0,5 ml reagens I wordt voorverwarmd tot 37 ℃, voeg 0,5 ml enzymoplossing toe, meng goed en incubeer bij37℃ gedurende 10 minuten.
2. Voeg 1 ml reagens II toe om de reactie te stoppen, meng goed en zet de incubatie gedurende 30 minuten voort.
3. Centrifugeer de reactieoplossing.
4. Neem 0,5 ml supernatant, voeg 2,5 ml reagens III en 0,5 ml reagens IV toe, meng goed en incubeer bij 37 ℃gedurende 30 minuten.
5. Buitendiameter660werd bepaald als OD1;blanco controlegroep: 0,5 ml reagens V wordt gebruikt om het enzym te vervangenoplossing om de OD te bepalen660als O.D2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Standaardcurve van L-tyrosine: 0,5 ml L-tyrosine-oplossing met verschillende concentratie, 2,5 ml reagens III, 0,5 ml reagens IV in 5 ml centrifugebuis, incubeer in 37 ℃ gedurende 30 minuten, detecteer op OD660voor verschillende concentraties L-tyrosine, vervolgens de standaardcurve Y=kX+b verkregen, waarbij Y de L-tyrosineconcentratie is, X is OD600.
Berekening
2: Totaal volume reactieoplossing (ml)
0,5: Volume enzymoplossing (ml)
0,5: Volume reactievloeistof gebruikt bij chromogene bepaling (ml)
10: Reactietijd (min)
Df: Verdunning meerdere
C: Enzymconcentratie (mg/ml)
Referenties
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biofysiek.Res.Gemeenschappelijk.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,EUR.J. Biochem.(1975);56: 103–108.
4. Sambrook Jet al., Moleculair klonen: een laboratoriumhandleiding, 2e editie, Cold Spring HarborLaboratoriumpers, Cold Spring Harbor (1989).
Figuren
Afb.1 Optimaal pH
100 mM bufferoplossing: pH 6,0-8,0, Na-fosfaat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl;pH9,0-12,5, glycine-NaOH. Enzymconcentratie: 1 mg/ml
Afb.2 Optimale temperatuur
Reactie in 20 mM K-fosfaatbuffer pH 8,0.Enzymconcentratie: 1 mg/ml
Afb.3 pH Stabiliteit
25 ℃, 16 uur behandeling met 50 mM bufferoplossing: pH 4,5- 5,5, acetaat;pH 6,0-8,0, Na-fosfaat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, glycine-NaOH.Enzymconcentratie: 1 mg/ml
Afb.4 Thermisch stabiliteit
Behandeling van 30 minuten met 50 mM Tris-HCl-buffer, pH 8,0.Enzymconcentratie: 1 mg/ml
Afb.5 Opslag stabielty at 25℃
