2×Sensi Direct Premix-UNG (Probe qPCR)
Katnummer: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) is ontworpen om PCR rechtstreeks uit monsters uit te voeren zonder DNA-extractie of monstervoorbereiding.Dit reagens bestaat uit hot-start DNA-polymerase, uracil DNA-glycosylase (UNG), RNase-remmer, MgCl2, dNTP's (met dUTP in plaats van dTTP) en stabilisatoren, voor kwantitatieve PCR (qPCR).Dit reagens heeft een hoge tolerantie voor remmers en kan daarom direct worden toegepast voor de detectie van monsters zoals keeluitstrijkjes, speeksel, anti-gecoaguleerd volbloed, plasma en serum zonder DNA-extractie.Het reagens maakt gebruik van een eigen buffer voor qPCR met gemengde enzymen van anti-remmend DNA-polymerase en UNG-enzym.Daarom kan het een goede amplificatie van doelgenen verkrijgen in monsters die remmers bevatten en vals-positieve amplificatie remmen die wordt veroorzaakt door PCR-resten en aërosolvervuiling.Dit reagens is compatibel met de meeste fluorescerende kwantitatieve PCR-instrumenten, zoals Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche enzovoort.
Componenten
1. 50×SensiDirect Enzym/UNG-mix
2. 2×SensiDirect-premixbuffer (dUTP)
Opslag condities
Alle componenten moeten bij -20℃ worden bewaard voor langdurige opslag en bij 4℃ voor maximaal 3 maanden.Na het ontdooien grondig mengen en voor gebruik centrifugeren.Vermijd veelvuldig invriezen en ontdooien.
Fietsprotocol
| Stap | Temperatuur | Tijd | Fiets |
| Spijsvertering | 50℃ | 2 minuten | 1 |
| Polymerase-activatie | 95℃ | 1-5min | 1 |
| Denatureren | 95℃ | 10-20s | 40-50 |
| Gloeien/verlenging | 56-64℃ | Jaren 20-60 |
Instructies voor pipetteren
| Reagens | Hoeveelheid per reactie | Volume per reactie | Laatste concentratie |
| 2×SensiDirect-premixbuffer (dUTP) | 12,5 µl | 25 µl | 1× |
| 50×SensiDirect Enzym/UNG-mix | 0,5 µl | 1 µl | 1× |
| 25×Primer-Probe-mix1, 2 | 1 µl | 2 µl | 1× |
| Steekproef3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Totale volume | 25 μl | 50 μl | - |
1. De uiteindelijke concentratie primer is gewoonlijk 0,2 μM.Voor betere resultaten kan de primerconcentratie worden geoptimaliseerd binnen het bereik van 0,2-1 μM.
2. Over het algemeen kan de sondeconcentratie worden geoptimaliseerd binnen het bereik van 0,1-0,3 μM.De optimale concentratie van de probe hangt samen met het real-time PCR-amplificatie-instrument, het type probe en het type fluorescerende labelstof.Raadpleeg de instrumenthandleiding of de specifieke vereisten van elke fluorescentiesonde.
3. Verschillende soorten monsters bevatten verschillende soorten en inhoud van de remmer en het aantal kopieën van het doelgen.Het monstervolume moet worden beoordeeld op basis van de feitelijke omstandigheden.Maak een verdunning van het monster door indien nodig nucleasevrij water of TE-buffer toe te voegen.
4. Aanbevolen volume van verschillende monsters:
| Steekproef | Volume voor één 50 μl reactie | Maximaal verhouding |
| Antistolling volbloed | 2,5 μl | 5% |
| Plasma | 15 μl | 30% |
| Serum | 10 μl | 20% |
| Keel staafje | 10 μl | 20% |
| Speeksel | 10 μl | 20% |
Kwaliteitscontrole
1. Functiedetectie: gevoeligheid, specificiteit en herhaalbaarheid van qPCR.
2. Geen exogene nucleaseactiviteit: geen exogene endonuclease- en exonucleasevervuiling.
Opmerkingen over producten
1. Dit product maakt gebruik van een nieuw type hot-start DNA-polymerase, dat binnen 1-5 minuten kan worden geactiveerd. Omdat de reactiebuffer is geoptimaliseerd, is het geschikter voor kwantitatieve PCR met dubbele of meervoudige fluorescentie met behulp van de probe-methode.
2. Als de Rn-waarde van de PCR-amplificatie te laag is of de amplificatie duidelijk wordt geremd, kan het verminderen van de monsterhoeveelheid, het verhogen van het reactievolume of eerdere verdunning van het monster de resultaten verbeteren.
3. Het verzamelen van bloed, speeksel, urine, keeluitstrijkjes, etc. moet voldoen aan de klinische criteria, en er kan een nieuw monster worden gebruikt om afbraak van nucleïnezuren te voorkomen.
4. Omdat verschillende amplicons een andere benuttingsefficiëntie hebben dan dUTP en gevoeligheid voor UNG, moeten de reagentia worden geoptimaliseerd als de detectiegevoeligheid afneemt bij gebruik van het UNG-systeem.Neem indien nodig contact met ons op voor technische ondersteuning.
5. Om amplificatie van overgedragen PCR-producten tussen eenstapsreacties te voorkomen, zijn voor amplificatie een speciaal experimenteel gebied en een pipet vereist.Werk met handschoenen en kleed u regelmatig om. Open de reageerbuis niet na PCR-amplificatie.
