Proteïnase K (vloeistof)
Katnummer: HC4502A
Proteinase K is een stabiel serineprotease met brede substraatspecificiteit.Het breekt veel eiwitten in de oorspronkelijke staat af, zelfs in de aanwezigheid van detergentia.Bewijs uit kristal- en moleculaire structuurstudies geeft aan dat het enzym behoort tot de subtilisinefamilie met een katalytische triade op de actieve plaats (Asp39-Zijn69- Ser224).De belangrijkste splitsingsplaats is de peptidebinding grenzend aan de carboxylgroep van alifatische en aromatische aminozuren met geblokkeerde alfa-aminogroepen.Het wordt vaak gebruikt vanwege zijn brede karakterspecificiteit.
Specificatie
| Verschijning | Kleurloze tot lichtbruine vloeistof |
| Activiteit | ≥800 E/ml |
| Eiwitconcentratie | ≥20 mg/ml |
| DNAse | Geen gedetecteerd |
| RNase | Geen gedetecteerd |
Opslag condities
Bewaren bij een temperatuur van 2-8℃.
Eigenschappen
| EG-nummer | 3.4.21.64 (Recombinant van Tritirachium-album) |
| Moleculair gewicht | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| ISO-elektrisch punt | 7.81 |
| Optimale pH-waarde | 7.0-12.0 Afb.1 |
| Optimale temperatuur | 65 ℃ Afb.2 |
| pH-stabiliteit | pH 4,5-12,5 (25℃, 16 uur) Afb.3 |
| Thermische stabiliteit | Onder 50℃ (pH 8,0, 30 minuten) Afb.4 |
| activatoren | SDS, ureum |
| remmers | Diisopropylfluorfosfaat;fenylmethylsulfonylfluoride |
Toepassingen
1. Kit voor genetische diagnose
2. RNA- en DNA-extractiekits
3. Extractie van niet-eiwitcomponenten uit weefsels, afbraak van eiwitonzuiverheden, zoals DNA-vaccins en bereiding van heparine
4. Bereiding van chromosoom-DNA door gepulseerde elektroforese
5. Westernvlek
6. Enzymatische geglycosyleerde albumine-reagentia in vitro-diagnose
Voorzorgsmaatregelen
Draag bij gebruik of wegen beschermende handschoenen en een veiligheidsbril en zorg voor een goede ventilatie na gebruik.Dit product kan een huidallergische reactie en ernstige oogirritatie veroorzaken.Bij inademing kan het allergische of astmasymptomen of kortademigheid veroorzaken.Kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken.
Analyse
Eenheidsdefinitie
Eén eenheid (U) wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om caseïne te hydrolyseren om 1 μmol tyrosine per minuut te produceren onder de volgende omstandigheden.
Bereiding van reagentia
Reagens I: 1 g melkcaseïne werd opgelost in 50 ml 0,1 M natriumfosfaatoplossing (pH 8,0), 15 minuten geïncubeerd in 65-70 ℃ water, geroerd en opgelost, gekoeld met water, aangepast met natriumhydroxide tot pH 8,0 en gefixeerd inhoud 100 ml.
Reagens II: TCA-oplossing: 0,1 M trichloorazijnzuur, 0,2 M natriumacetaat, 0,3 M azijnzuur.
Reagens III: 0,4M Na2CO3oplossing.
Reagens IV: Forint-reagens 5 keer verdund met zuiver water.
Reagens V: Enzymverdunningsmiddel: 0,1 M natriumfosfaatoplossing (pH 8,0).
Reagens VI: Tyrosine-oplossing: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tyrosine opgelost met 0,2 M HCl.
Procedure
1. 0,5 ml reagens I wordt voorverwarmd tot 37 ℃, voeg 0,5 ml enzymoplossing toe, meng goed en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ℃.
2. Voeg 1 ml reagens II toe om de reactie te stoppen, meng goed en zet de incubatie gedurende 30 minuten voort.
3. Centrifugeer de reactieoplossing.
4. Neem 0,5 ml supernatant, voeg 2,5 ml reagens III en 0,5 ml reagens IV toe, meng goed en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ℃.
5. Buitendiameter660werd bepaald als OD1;blanco controlegroep: 0,5 ml reagens V wordt gebruikt ter vervanging van de enzymoplossing om de OD te bepalen660als O.D2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Standaardcurve van L-tyrosine: 0,5 ml L-tyrosine-oplossing met verschillende concentratie, 2,5 ml reagens III, 0,5 ml reagens IV in 5 ml centrifugebuis, incubeer in 37 ℃ gedurende 30 minuten, detecteer op OD660voor verschillende concentraties L-tyrosine, vervolgens de standaardcurve Y=kX+b verkregen, waarbij Y de L-tyrosineconcentratie is, X is OD600.
Berekening
2: Totaal volume reactieoplossing (ml)
0,5: Volume enzymoplossing (ml)
0,5: Volume reactievloeistof gebruikt bij chromogene bepaling (ml)
10: Reactietijd (min)
Df: Verdunning meerdere
C: Enzymconcentratie (mg/ml)
Referenties
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biofysiek.Res.Gemeenschappelijk.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,EUR.J. Biochem.(1975);56: 103–108.
4. Sambrook Jet al., Moleculair klonen: A Laboratory Manual, 2e editie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Figuren
Afb. 1 Optimaal pH
100 mM bufferoplossing: pH 6,0-8,0, Na-fosfaat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl;pH9,0-12,5, glycine-NaOH. Enzymconcentratie: 1 mg/ml
Afb. 2 Optimale temperatuur
Reactie in 20 mM K-fosfaatbuffer pH 8,0.Enzymconcentratie: 1 mg/ml
Afb. 3 pH Stabiliteit
25℃, 16 uur behandeling met 50 mM bufferoplossing: pH 4,5-5,5, acetaat;pH 6,0-8,0, Na-fosfaat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, glycine-NaOH.Enzymconcentratie: 1 mg/ml
Afb. 4 Thermisch stabiliteit
Behandeling van 30 minuten met 50 mM Tris-HCl-buffer, pH 8,0.Enzymconcentratie: 1 mg/ml
Afb. 5 Opslag stabielty at 25℃
