Superstart qPCR Premix plus-UNG
Katnummer: HCB5071E
Superstart qPCR Premix plus-UNG is een gespecialiseerd reagens ontworpen voor realtime PCR kwalitatieve en kwantitatieve reacties met behulp van op sondes gebaseerde detectie, speciaal ontwikkeld voor lyofilisatieprocessen.Het bevat een nieuw hot-start-enzym Hotstart Taq plus (DG), waarvan de Taq-enzymactiviteit bij kamertemperatuur is verzegeld, waardoor niet-specifieke amplificatie, veroorzaakt door niet-specifieke primer-annealing of primer-dimeervorming onder lage temperatuuromstandigheden, effectief wordt geremd, waardoor de de specificiteit van de amplificatiereactie.Dit reagens maakt gebruik van een geoptimaliseerde qPCR-specifieke buffer en een UNG/dUTP-anticontaminatiesysteem om een snelle warmstart te bereiken, waardoor de efficiëntie en gevoeligheid van qPCR-reacties aanzienlijk worden verbeterd.Het kan goede standaardcurven verkrijgen in een breed scala aan kwantificeringsgebieden en kwantificering nauwkeurig uitvoeren, waardoor vals-positieve amplificatie, veroorzaakt door resterende PCR-producten of aerosolverontreiniging, effectief wordt voorkomen.Dit reagens is compatibel met de meeste fluorescerende kwantitatieve PCR-instrumenten van fabrikanten zoals Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad en Roche enz., en vertoont een goede stabiliteit in gelyofiliseerde vorm.
Samenstelling reagens
1. 5×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+gratis) (DG)
2. 250 mM MgCl2
3. 4×lyoprotectant (optioneel)
Opslag condities
Langdurige opslag bij -20℃;kan tot 3 maanden bij 4℃ worden bewaard.Goed mengen voor gebruik envermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien.
Fietsprotocol
| Procedure | Temp. | Tijd | Fiets |
| Spijsvertering | 50℃ | 2 minuten | 1 |
| Polymerase-activatie | 95℃ | 1~5 min | 1 |
| Denatureren | 95℃ | 10~20 sec | 40-50 |
| Gloeien en verlengen | 56~64℃ | 20~60 sec | 40-50 |
qPCR Vloeistofreactie Systengel voorbereiding
|
Samenstelling |
25 µl volume |
50 µl volume |
Laatste concentratie |
| 5×HotstartPremix plus-UNG(Mg2+gratis) (DG) | 5 µl | 10 µl | 1× |
| 250 mM MgCl2 | 0,45 µl | 0,9 µl | 4,5 mm |
| 4×lyoprotectant1 | 6,25 µl | 12,5 µl | 1× |
| 25×Primer-Probe-mix2 | 1 µl | 2 µl | 1× |
| Sjabloon-DNA3 | —— | —— | —— |
| ddH2O | Tot 25 µl | Tot 50 µl | —— |
1. Een eindconcentratie van 0,2 μM voor primers levert doorgaans goede resultaten op;als de reactieprestaties slecht zijn, pas dan indien nodig de primerconcentratie aan binnen het bereik van 0,2-1 μM.De probeconcentratie wordt doorgaans geoptimaliseerd binnen het bereik van 0,1-0,3 μM door middel van gradiëntexperimenten om optimale combinaties te vinden.
2. Het aantal kopieën van doelgenen in verschillende typen templates varieert;indien nodig kan gradiëntverdunning worden uitgevoerd om de optimale hoeveelheid templatetoevoeging te bepalen.
3. Dit systeem kan worden gevriesdroogd;Wanneer klanten dit systeem gebruiken zonder vereisten voor vriesdrogen, kan 4×lyoprotectant selectief worden toegevoegd; als er gevriesdroogde producten nodig zijn, moet tijdens de validatie van de productprestaties in de vloeibare reagentiafase 4×lyoprotectant worden toegevoegd om consistentie met de gelyofiliseerde systeemcomponenten te garanderen en effecten.
Wanneer het systeem in gebruik isd voor vriesdrogen: bereid de systeem as als vervolg op:
| Samenstelling | 25µL Reactiesysteem |
| 5 ×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+gratis) (DG) | 5 µl |
| 250 mM MgCl2 | 0,45 µl |
| 4×lyoprotectant | 6,25 µl |
| 25×Primer-Probe-mix | 1 µl |
| ddH2O | Tot 18~20 µl |
*Als andere systemen voor vriesdrogen nodig zijn, raadpleeg dan afzonderlijk.
Lyofilisatieprocesss
| Procedure | Temp. | Tijd | Voorwaarde | Druk |
| Voorvriezen | 4℃ | 30 minuten | Uitstel |
1 atm |
| -50℃ | 60 min | Koeling | ||
| -50℃ | 180 min | Uitstel | ||
| Primaire droging | -30℃ | 60 min | Verwarming |
Ultiem vacuüm |
| -30℃ | 70 min | Uitstel | ||
| Secundair drogen | 25℃ | 60 min | Verwarming |
Ultiem vacuüm |
| 25℃ | 300 min | Uitstel |
2. Het bovenstaande lyofilisatieproces is alleen ter referentie.Verschillende producttypes en verschillende vriesdrogers hebben verschillende parameters, dus aanpassingen kunnen worden gemaakt op basis van de werkelijke situatieomstandigheden tijdens gebruik.
3. Verschillende lyofilisatieprocessen kunnen geschikt zijn voor verschillende batchgroottes van gevriesdroogd materiaalproducten, dus er moet voldoende testvalidatie worden uitgevoerd bij gebruik voor grootschalige productie.
Instructies voor het gebruik van lyofiliserend poeder
1. Centrifugeer het gevriesdroogde poeder kort;
2. Voeg het nucleïnezuursjabloon toe aan het gelyofiliseerde poeder en voeg water toe tot 25 µl;
3. Goed mengen door centrifugeren en op de machine laten draaien.
Kwaliteitscontrole:
1. Functioneel testen: gevoeligheid, specificiteit, reproduceerbaarheid van qPCR.
2. Geen exogene nucleaseactiviteit, geen exogene endo/exonucleaseverontreiniging.
Technische informatie:
1. Superstart qPCR Premix plus-UNG maakt gebruik van een nieuw hot-start-enzym dat een snelle hot-start binnen 1-5 minuten mogelijk maakt;door speciale bufferformulering is het geschikt voor multiplex fluorescente kwantitatieve PCR-reacties.
2. Het heeft een hogere specificiteit, wat de gevoeligheid van fluorescentie-kwantitatieve PCR-limietdetectie aanzienlijk verbetert, waardoor de amplificatiecurven normaliseren, de fluorescentiewaarde een duidelijke verbetering verkrijgt bij lage concentratiesjablonen, geschikt als fluorescentie-kwantitatieve PCR-detectiereagentia met hoge gevoeligheid.
3. Voor primers met een lagere uitgloeitemperatuur of fragmenten met een lengte van meer dan 200 bp wordt de driestapsmethode aanbevolen.
4. De gebruiksefficiëntie van dUTP en de gevoeligheid voor het UNG-enzym verschillen voor verschillende doelgenen. Als het gebruik van het UNG-systeem dus leidt tot een afname van de detectiegevoeligheid, moet het reactiesysteem worden aangepast en geoptimaliseerd.Als technische ondersteuning nodig is, neem dan contact op met ons bedrijf.
5. Gebruik speciale gebieden en pipetten voor en na de amplificatie, draag handschoenen tijdens het gebruik en vervang ze regelmatig;Open de reageerbuis niet na voltooiing van de PCR om besmetting van monsters door PCR-producten tot een minimum te beperken.
