Rnase-remmer
Muriene RNase-remmer is een recombinante muizen-RNase-remmer, tot expressie gebracht en gezuiverd uit E.coli.Het bindt zich aan RNase A, B of C in een verhouding van 1:1 door middel van niet-covalente binding, waardoor de activiteit van de drie enzymen wordt geremd en RNA tegen afbraak wordt beschermd.Het is echter niet effectief tegen RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H of RNase van Aspergillus.Muizen-RNase-remmer werd getest met RT-PCR, RT-qPCR en IVT-mRNA en was compatibel met verschillende commerciële reverse-transcriptasen, DNA-polymerasen en RNA-polymerasen.
Vergeleken met menselijke RNase-remmers bevat muizen-RNase-remmer geen twee cysteïnen die zeer gevoelig zijn voor oxidatie die inactivatie van de remmer veroorzaakt.Dat maakt het stabiel bij lage concentraties DTT (minder dan 1 mM).Deze eigenschap maakt het geschikt voor gebruik bij reacties waarbij hoge concentraties DTT de reactie nadelig beïnvloeden (bijv. Real-time RT-PCR).
Atoepassing
Dit product kan op grote schaal worden gebruikt in elk experiment waarbij RNase-interferentie mogelijk is om RNA-degradatie te voorkomen, zoals:
1.Synthese van de eerste cDNA-streng, RT-PCR, RT-qPCR, enz.
2.Beschermt RNA tegen afbraak tijdens in vitro transcriptie/translatie (bijv. in vitro virusreplicatiesysteem).
3.Remming van RNase-activiteit tijdens RNA-scheiding en -zuivering.
Opslag condities
Het product kan worden bewaard bij -25~- 15 ℃, 2 jaar geldig.
Opslagbuffer
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7,6, 25 ℃), 8 mM DTT en 50% glycerol.
Eenheidsdefinitie
De hoeveelheid muizen-RNase-remmer die nodig is om de activiteit van 5 ng ribonuclease A met 50% te remmen, werd gedefinieerd als één eenheid (U).
Molecuulgewicht van eiwit
Het molecuulgewicht van de muizen-RNase-remmer is 50 kDa.
Kwaliteitscontrole
Exonuclease Activiteit:
40 U muizen-RNase-remmer met 1 μg λ-HindIII-digest DNA bij 37 ° C gedurende 16 uur levert geen afbraak op, zoals bepaald door agarosegelelektroforese.
Endonuclease-activiteit:
40 U muizen-RNase-remmer met 1 μg λ-DNA bij 37 ° C gedurende 16 uur levert geen afbraak op, zoals bepaald door agarosegelelektroforese.
Nickeren Activiteit:
40 U muizen-RNase-remmer met 1 μg pBR322 bij 37 ° C gedurende 16 uur levert geen afbraak op, zoals bepaald door agarosegelelektroforese.
RNase Activiteit:
40 U muizen-RNase-remmer met 1,6 μg MS2-RNA gedurende 4 uur bij 37 °C levert geen afbraak op, zoals bepaald door agarosegelelektroforese.
E.coli-DNA:
40 U muizen-RNase-remmer wordt gescreend op de aanwezigheid van genomisch DNA van E. coli met behulp van TaqMan qPCR met primers die specifiek zijn voor de E. coli 16S rRNA-locus.De genomische DNA-contaminatie van E. coli is ≤ 0,1 pg/40 U.
Nnoots
1. Gewelddadige oscillatie of roeren zal leiden tot inactivering van het enzym.
2. Het optimale temperatuurbereik van deze remmer was 25-55 ℃ en werd geïnactiveerd bij 65 ℃ en hoger.
3. De activiteiten van RNase H, RNase 1 en RNase T1 werden niet geremd door RNase-remmer van muis.
4. De remming van RNase-activiteit werd gevonden in een breed pH-bereik (pH 5-9 waren allemaal actief) en de hoogste activiteit werd waargenomen bij pH 7-8.
5. Omdat ribonucleasen doorgaans hun activiteit behouden onder denaturerende omstandigheden, moet erop worden gelet dat denaturerende RNase-remmermoleculen die een complex hebben gevormd met een ribonuclease worden vermeden.Om de afgifte van actieve ribonuclease te voorkomen, moeten temperaturen hoger dan 50 °C en hoge concentraties ureum of andere denaturerende middelen worden vermeden.
