Vaccinia Virus Capping-enzym

Vaccinia-virus-capping-enzym is afgeleid van een recombinante E. coli-stam die de genen voor het Vaccinia-capping-enzym draagt.Dit enkele enzym bestaat uit twee subeenheden (D1 en D12) en heeft drie enzymatische activiteiten (RNA-trifosfatase en guanylyltransferase door de D1-subeenheid en guaninemethyltransferase door de D12-subeenheid).Vaccinia virus Capping Enzyme is effectief in het katalyseren van de vorming van de cap-structuur, die specifiek de 7-methylguanylaat cap-structuur (m7Gppp, Cap 0) aan het 5'-uiteinde van RNA kan hechten.Cap-structuur (Cap 0) speelt een belangrijke rol bij de stabilisatie, het transport en de vertaling van mRNA in eukaryoten.Het afdekken van RNA door enzymatische reactie is een effectieve en eenvoudige methode die de stabiliteit en vertaling van RNA voor in vitro transcriptie, transfectie en micro-injectie aanzienlijk kan verbeteren.

Componenten

Vaccinia Virus-afdekkend enzym (10 U/μl)

10×Capping-buffer

Opslag condities

-25~- 15℃ voor opslag (Vermijd herhaalde vries-dooicycli)

Opslagbuffer

20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl,

1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50% glycerol.

Eenheidsdefinitie

Eén eenheid Vaccinia virus Capping Enzyme wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om 10 pmol GTP in 1 uur bij 37°C in een transcript van 80 nt op te nemen.

Kwaliteitscontrole

Exonuclease:10 U Vaccinia-virus Capping-enzym met 1 μg λ-Hind III verteert DNA bij 37 ℃ gedurende 16 uur levert geen afbraak op, zoals bepaald door agarosegelelektroforese.

Endonuclease:10 U Vaccinia-virus Capping-enzym met 1 μg λDNA bij 37 ℃ gedurende 16 uur levert geen afbraak op, zoals bepaald door agarosegelelektroforese.

Bijnaam:10 U Vaccinia virus Capping Enzym met 1 μg pBR322 bij 37 ℃ gedurende 16 uur levert geen afbraak op, zoals bepaald door agarosegelelektroforese.

RNase:10 U Vaccinia virus Capping Enzym met 1,6 μg MS2 RNA gedurende 4 uur bij 37 ℃ levert geen afbraak op, zoals bepaald door agarosegelelektroforese.

1.coli-DNA:10 U Vaccinia virus Capping Enzyme wordt gescreend op de aanwezigheid van genomisch DNA van E. coli met behulp van TaqMan qPCR met primers die specifiek zijn voor de E. coli 16S rRNA-locus.De genomische DNA-besmetting van E. coli is≤1 E. coli-genoom.

2.Bacterieel Endotoxine: LAL-test, volgens Chinese Farmacopee IV editie 2020, gellimiettestmethode, algemene regel (1143).Het bacteriële endotoxinegehalte moet ≤10 EU/mg zijn.

Reactiesysteem en omstandigheden

1. Aftoppingsprotocol (reactievolume: 20 μL)

Deze procedure is toepasbaar op de capping-reactie van 10μg RNA (≥100 nt) en kan worden opgeschaald volgens experimentele eisen.

I) Combineer 10 μg RNA en nucleasevrij H2O in een microfugebuisje van 1,5 ml tot een eindvolume van 15,0 µl.*10 × Capping-buffer: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

2) Verwarm gedurende 5 minuten op 65℃, gevolgd door een ijsbad gedurende 5 minuten.

3) Voeg de volgende componenten toe in de aangegeven volgorde

*10 x cappingbuffer: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8,0)

4) Incubeer gedurende 30 minuten bij 37°C. Het RNA is nu afgedekt en klaar voor verdere toepassingen.

2. 5′-terminal labelende reactie (reactievolume: 20 μL)

Dit protocol is ontworpen om RNA te labelen dat een 5´-trifosfaat bevat en kan naar behoefte worden opgeschaald.De efficiëntie van de labelopname zal worden beïnvloed door de molaire verhouding van RNA:GTP, evenals door het GTP-gehalte in RNA-monsters.

1) Combineer de juiste hoeveelheid RNA en nucleasevrij H2O in een microfugebuisje van 1,5 ml tot een eindvolume van 14,0 µl.

2) Verwarm gedurende 5 minuten op 65℃, gevolgd door een ijsbad gedurende 5 minuten.

3)Voeg de volgende componenten toe in de aangegeven volgorde.

** GTP MIX verwijst naar GTP en een klein aantal markers.Voor de concentratie van GTP, ziebij noot 3.

4) Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C. Het 5'-uiteinde van RNA is nu gelabeld en klaar voor stroomafwaarts

Toepassingen

1. mRNA afdekken voorafgaand aan translatietesten/in vitro vertaling

2. Labeling van het 5'-uiteinde van mRNA

Opmerkingen over gebruik

1.Het verwarmen van de oplossing van RNA vóór incubatie met het Vaccinia Capping Enzyme verwijdert de secundaire structuur aan het 5'-uiteinde van het transcript.Verleng de tijd tot 60 minuten voor transcripties met bekende, zeer gestructureerde 5'-uiteinden.

2. RNA dat voor capping-reacties wordt gebruikt, moet vóór gebruik worden gezuiverd en in nucleasevrij water worden gesuspendeerd.EDTA mag niet aanwezig zijn en de oplossing moet zoutvrij zijn.

3. Voor het labelen van het 5'-uiteinde moet de totale GTP-concentratie ongeveer 1-3 keer de molaire concentratie van mRNA in de reactie zijn.

4. Het volume van het reactiesysteem kan afhankelijk van de werkelijkheid worden vergroot of verkleind.