Dnase-testkit (fluorescentie)

Sollicitatie

Deze kit wordt gebruikt om DNase-besmetting in monsters te detecteren.

Ctegenstanders

Opslag en stabiliteit

1.Getransporteerd in -25 ~ – 15 ℃;

2.De verschillende componenten van de kit worden afhankelijk van de temperatuur afzonderlijk bewaard:

1. Bewaar de ongeopende set gedurende 12 maanden.

2.Bewaar de kit gedurende 6 maanden na opening.Het wordt aanbevolen om de DNA-probe-oplossing te verdelen in overeenstemming met de hoeveelheid voor eenmalig gebruik om licht en herhaaldelijk invriezen en ontdooien te voorkomen.

Benodigde apparatuur en verbruiksartikelen

1.Fluorescentie-microplaatlezer (inclusief ex/em=485/525 nm golflengte)

2.DNase&RNase-vrije pipetten en tips

3.DNase&RNase-vrije EP-buis

4.DNase&RNase-vrije zwarte, niet-transparante plaat met 96 putjes

Voorbereiding van reagentia

1.Haal de kit eruit en breng deze op kamertemperatuur (18~25℃), schud en meng de componenten zoals 10×reactieoplossing, TE-buffer, DNase I-standaard (2U/μL), standaardverdunningsbuffer, en centrifugeer vervolgens onmiddellijk.(Centrifugeer gedurende 10 seconden bij 4000~7000 tpm).

2.Centrifugeer de DNA-sonde gedurende 60 seconden bij 4000 ~ 7000 rpm om deze op de bodem van de buis te verzamelen, open voorzichtig de dop van de buis en voeg 40 μL TE-buffer toe om op te lossen als de opslagoplossing voor de DNA-sonde. Verdeel de opslagoplossing voor de DNA-sonde volgens de hoeveelheid voor eenmalig gebruik en bewaar ze bij -25 ~ -15 °C om herhaaldelijk invriezen en ontdooien te voorkomen.Haal de sondebewaaroplossing eruit elke keer dat u test, verdun deze 50 keer met TE-buffer (voeg bijvoorbeeld 490 μL TE-buffer toe aan 12 μL DNA-sonde) als de werkende oplossing voor de DNA-sonde.Bewaar de rest van de werkende oplossing van de DNA-sonde bij -25 ~ -15 °C om licht en herhaaldelijk invriezen en ontdooien te voorkomen.

Detectie stappen

1.Stel de juiste versterking in vóór de eerste test, om het risico van gevoeligheidsverlies of signaaloververzadiging te voorkomen.

1) instrumentparameters:

Schudplaat 10 ~ 15s vóór detectie;

Excitatiegolflengte λEx=485 nm;

Emissiegolflengte λEm=525 nm;

Gebruik de automatische versterkingsfunctie;

Temperatuur 37℃;

Eindpuntmodus.

Stel de versterking indien mogelijk in op automatisch schalen, of gebruik in eerste instantie een gemiddelde versterkingsinstelling.

Let op: de instelmethode van verschillende instrumenten is niet consistent. Raadpleeg de leverancier van het instrument voor meer informatie.

2) Selecteer 2 putjes op een plaat met 96 putjes, voeg 10 μl DNA-probe-werkoplossing en 10 μl 10×reactie-oplossing toe aan elk putje;

3) Voeg 80 μl DNase- en RNase-vrij water toe aan de ene put, en voeg 79 μl DNase- en RNase-vrij water en 1 μl DNase I-standaard (2U/μL) toe aan de andere put.

4) Plaats de plaat op een donkere plaats bij 37°C en test deze na 30 minuten.

5) Als u de versterking instelt op automatisch schalen, wordt de versterkingswaarde weergegeven in de instrumentparameterbalk van het gegevensbestand, aangegeven als G1.

6) Wanneer u aanvankelijk een gemiddelde versterkingsinstelling gebruikt, moet u er rekening mee houden dat: als de hoge fluorescentiewaarde de bovengrens van het instrument overschrijdt, de versterkingswaarde op passende wijze moet worden verlaagd;als de hoge fluorescentiewaarde ver onder de bovengrens van het instrument ligt, moet de versterkingswaarde op passende wijze worden verhoogd;Tenslotte wordt de juiste versterkingswaarde verkregen, aangeduid als G2.

2.Stel de instrumentparameters in:

Schudplaat 10 ~ 15s vóór detectie;

Excitatiegolflengte λEx=485 nm;

Emissiegolflengte λEm=525 nm;

Stel de versterkingswaarde in op G1 of G2, verkregen in stap 1;

Temperatuur 37℃;

Als de microplaatlezer de kinetische modus ondersteunt, wordt aanbevolen om de kinetische detectiemodus te gebruiken, met een interval van 1 tot 1,5 minuten, en de totale tijd is 30 minuten.

3.Monstervoorbereiding

Het aanbevolen monstervolume is 80 μl.Als het te testen monster kleiner is dan 80 μl, verdun dan tot 80 μl met DNase＆RNase-vrij water.

Wanneer het te testen monster stoffen bevat die de luminescentie van de fluorofoor beïnvloeden (zoals donkere oplossingen, viskeuze stoffen met een hoge concentratie of oppervlakteactieve stoffen), moet het monster worden verdund met DNase- en RNase-vrij water, maar houd er rekening mee dat de verdunning invloed heeft op de gevoeligheid.Voor het te testen monster dat DNase-activiteitsremmers bevat (zoals oplossingen met een hoge ionsterkte, pH<4 of pH>9 buffers, eiwitdenaturanten, enz.), is het meetresultaat de algehele enzymactiviteit van de monsteroplossing, niet de individuele activiteit van het enzym.

Verdun DNase I-standaard (2U/μL) als volgt met standaardverdunningsbuffer:

 Verdun monster nr. 2 10 keer met DNase- en RNase-vrij water:

Monster nr. 3 wordt gebruikt als positieve controle;Als negatieve controle wordt DNase&RNase-vrij water gebruikt.

1. Doseren en testen

1) Voeg 10 μl DNA-sonde-werkoplossing en 10 μl 10×Reaction-oplossing toe aan de plaat met 96 putjes.Selecteer 4 putjes om respectievelijk de negatieve controle en de positieve controle toe te voegen, en de andere putjes om de te testen monsters toe te voegen.Er zijn 2 meerdere putjes voor elk monster, 80 μL voor elk putje;

2) Test onmiddellijk de fluorescentiesignaalwaarde RFU0 en lees deze af gedurende 0 minuten.Nadat het gedurende 30 minuten in het donker bij 37 ℃ is geplaatst, test en lees de fluorescentiesignaalwaarde RFU30 opnieuw gedurende 30 minuten.Als de dynamische modus wordt toegepast, kunnen alle fluorescentiesignalen gedurende 0 ~ 30 minuten worden gelezen.

Interpretatie van testresultaten

Als RFU30≥2×RFU0 wordt aangenomen dat het te testen monster besmet is met DNase.

Let op: indien het te testen monster ernstig verontreinigd is of storende stoffen bevat, kan het voorkomen dat RFU0 (te testen monster) > RFU0 (positieve kwaliteitscontrole) en RFU30 (te testen monster) < 2 ×RFU0 (te testen monster) getest), wat leidt tot een vals-negatief oordeel.Op dit moment moet het te testen monster vooraf worden verdund met DNase- en RNase-vrij water en vervolgens worden getest.

Kwantitatieve detectie

Wanneer het te testen monster besmet is en het noodzakelijk is om de concentratiewaarde van DNase in het monster te beoordelen, kan dit worden bepaald via de volgende procedures:

Verdun DNase I-standaard (2U/μL) als volgt met standaardverdunningsbuffer:

Verdun vervolgens monsters nr. 3 ~ nr. 5 10 keer met DNase- en RNase-vrij water:

Monsters nr. 7 ~ nr. 10 worden als standaard gebruikt;DNase ＆ RNase-vrij water als monster met een concentratie van 0.

Test monster met 0-concentratie, standaarden en verontreinigd monster samen volgens de detectiestappen om RFU0 en RFU30 te verkrijgen. Bereken ∆RFU = RFU30-RFU0, neem ∆RFU (0-concentratie) en ∆RFU (standaard) als ordinaat en DNase I-concentratie van de standaard als de abscis (concentratie 0 is 0), voer een lineaire aanpassing uit en bereken de aanpassingsvergelijking y = ax + B, en de correlatiecoëfficiënt r moet ≥ 0,99 zijn.Neem ∆RFU (verontreinigd monster) in de vergelijking op als y, bereken x en vermenigvuldig dit met het veelvoud van de pre-verdunning van het monster om de geschatte concentratiewaarde van het verontreinigde monster te verkrijgen.

Opmerking: vanwege fluctuaties in het instrumentsignaal kan het voorkomen dat ∆RFU<0. Op dit moment wordt dit berekend als ∆RFU=0.

Detectieprestaties

1. Detectielimiet: DNase I: 1,25×10-6U/μL

2. Precisie: variatiecoëfficiënt tussen batches ≤ 10%, variatiecoëfficiënt tussen batches ≤ 15%

Aandacht

1. Het toevoegen van monsters moet zo snel mogelijk gebeuren.Een te lange tijd zal de nauwkeurigheid van het experiment beïnvloeden.

2. De parameters van verschillende instrumenten voor het labelen van fluorescerende enzymen zijn verschillend.Stel de juiste versterking in vóór de eerste test.

3. Alle reagentia moeten vóór gebruik volledig worden geschud.Bij het toevoegen van monsters moeten de toegevoegde monsters aan de onderkant van de enzymlabelplaat worden toegevoegd om te voorkomen dat ze aan het bovenste deel van de putwand worden toegevoegd.Let er bij het toevoegen van monsters op dat u niet spettert of luchtbellen genereert.

4. De standaard in de kit is DNase I, en de actieve eenheid ervan wordt gedefinieerd als één eenheid die wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die 1 µg pBR322-DNA in 10 minuten bij 37°C in DNase I-reactiebuffer volledig zal afbreken. 1].Eén DNase I-eenheid komt overeen met 0,3 Kunitz-eenheid[2].

5. Om exogene DNase-contaminatie te voorkomen, kan DNase RNase Away op het oppervlak van de experimentele tafel, handschoenen en andere oppervlakken worden gespoten.Maak ze na 5 minuten schoon met schoon keukenpapier en voer vervolgens de daaropvolgende experimentele handelingen uit.