In vitro transcriptiereagens met hoge opbrengst T7 (thermostabiel)
De T7 in vitro transcriptiereagenskit met hoge opbrengst (thermostabiel) is in staat tot in vitro transcriptie bij hogere temperaturen tot 50°C.De kit is in staat RNA-transcripten met hoge opbrengst te synthetiseren met behulp van lineair dubbelstrengs DNA dat de T7-promoter als matrijs en NTP's als substraat bevat.De kit is geschikt voor het incorporeren van gemodificeerde nucleotiden om met biotine gelabeld, met kleurstof gelabeld en radioactief gelabeld RNA te verkrijgen.De kit kan ook worden toegepast bij de synthese van co-transcriptioneel capterende mRNA's met cap-analogen.De kit bevat als alternatief gemodificeerde nucleotiden N1-Me-pUTP.
Elke standaardreactie levert tot 150-200 μg RNA op uit 1 μg DNA-sjabloon.De reactiegrootte kan indien nodig worden opgeschaald om RNA op milligramniveau te verkrijgen.
Het uit de kit gesynthetiseerde RNA is geschikt voor vele toepassingen, waaronder onderzoek naar de structuur en functie van RNA, biochemie van ribozym, RNase-beschermingstesten en op hybridisatie gebaseerde blots, anti-sense RNA en RNAi-experimenten.Het uit de kit gesynthetiseerde RNA is ook geschikt voor de productie van enzymatische productie van afgedekt RNA door vaccinia-capping-enzym en 2'-O-methyltransferase en wordt aangevuld met poly(A)-polymerase om de stabiliteit en translationele competentie van RNA dat wordt gebruikt voor in vitro vertaling te verbeteren , transfectie en micro-injectie.
Componenten
| Onderdeel | Concentratie | Volume |
| ATP | 100 mM | 100 μl |
| CTP | 100 mM | 100 μl |
| GTP | 100 mM | 100 μl |
| UTP | 100 mM | 100 μl |
| N1-Me-pUTP | 100 mM | 100 μl |
| 10 × IVT-buffer met hoog rendement A | / | 100 μl |
| Enzymmix (Thermostabiel) | / | 100 μl |
Opslag condities
Transport onder 0°C en opslag bij -25~- 15°C.
Protocol
•DNA-sjabloonvoorbereiding
Gelineariseerd plasmide-DNA, PCR-producten of synthetische DNA-oligonucleotiden kunnen met de kit worden gebruikt als sjablonen voor in vitro transcriptie. Het DNA-sjabloon kan worden opgelost in TE-buffer of RNase-vrij ddH2O.
•Plasmide Sjablonen: Het gelineariseerde plasmide moet een T7-promotergebied als DNA-matrijs bevatten.De kwaliteit van het gelineariseerde plasmide beïnvloedt de opbrengst en integriteit van RNA.Een volledig gelineariseerd plasmidesjabloon met de hoogste zuiverheid is van cruciaal belang voor succesvol gebruik van de kit, omdat circulair plasmide niet effectief wordt beëindigd.De hoogste transcriptieopbrengst wordt bereikt met de template met de hoogste zuiverheid.Om RNA-transcript met een gedefinieerde lengte te produceren, moet plasmide-DNA volledig worden gelineariseerd met een restrictie-enzym dat stompe uiteinden of 5'-overhangen genereert.Het gelineariseerde plasmide dat door laboratoriummethoden is gezuiverd, kan vrij zijn van verontreinigende RNase, eiwit, RNA en zouten.
• PCR-sjablonen: PCR-producten die de T7-RNA-polymerasepromoter in de juiste oriëntatie bevatten, kunnen worden getranscribeerd.Betere opbrengsten zullen worden verkregen met gezuiverde PCR-producten, hoewel PCR-mengsels direct kunnen worden gebruikt.
•Synthetisch DNA oligonnucleotiden:Synthetische DNA-oligonucleotiden die ofwel volledig dubbelstrengig zijn, ofwel grotendeels enkelstrengs met een dubbelstrengige T7-promotersequentie, kunnen worden getranscribeerd
RNA-syntheseprotocollen
Het wordt sterk aanbevolen om handschoenen te dragen en nucleasevrije buizen en reagentia te gebruiken om RNase-contaminatie te voorkomen.Reacties met een klein volume moeten worden verzameld in nucleasevrije microfugebuisjes of PCR-stripbuisjes.
Conventionele RNA-synthese
1. Ontdooi de benodigde kitcomponenten, meng en draai pulserend in de microfuge om oplossingen op de bodem van de buisjes te verzamelen.Blijf op ijs.
2. Als u van plan bent veel reacties uit te voeren, is het handig om een mastermix te bereiden door gelijke volumes van de 10× Hi-Yield IVT Buffer en vier ribonucleotide (NTP)-oplossingen te combineren.Gebruik 10 µl mastermix per reactie.
3. Monteer de reactie bij kamertemperatuur in de volgende volgorde:
| Reagens | Hoeveelheid |
| Nucleasevrij water | X μL |
| 10 × IVT-buffer met hoog rendement A | 2 μl |
| ATP/CTP/GTP/UTP *(elk 100 mM) | 2 μL elk (10 mM elk Final) |
| Sjabloon-DNA | Y μL (1 μg) |
| Enzymmix (Thermostabiel) | 2 μl |
| Totaal reactievolume | 20 μl |
* Om de immunogeniciteit van het product te verminderen, kan UTP worden vervangen door N1-Me-pUTP in dezelfde eindconcentratie.
4. Meng grondig en pulseer centrifugeren in de microfuge.Incubeer gedurende 2 uur bij 37°C, of 1 uur bij 50°C als een reactie bij hoge temperatuur vereist is.
5. DNA-digestie: Om template-DNA te verwijderen, voegt u 10U DNase I toe aan elke 20 μl reactie, mengt u goed en incubeert u gedurende 30 minuten bij 37°C.
Afgedekte RNA-synthese
Gelijkaardig protocol als conventionele RNA-synthese, behalve de stap van het samenstellen van de reactie.Monteer de reactie van afgedekte RNA-synthese bij kamertemperatuur in de volgende volgorde:
| Reagens | Hoeveelheid |
| Nucleasevrij water | X μL |
| 10 × IVT-buffer met hoog rendement A | 2 μl |
| ATP/CTP/GTP/UTP *(elk 100 mM) | 2 μl elk (10 mM elk definitief) |
| Kap analoog (100 mM) | 1,6 μl |
| Sjabloon-DNA | Y μL (1 μg) |
| Enzymmix (Thermostabiel) | 2 μl |
| Totaal reactievolume | 20 μl |
*** Indien nodig kunnen Cap1(3'OH AG) en cap1(3'OMe AG) ascap-analogen worden gebruikt.Wij raden ons co-transcriptiereagens Co-capping T7 in vitro transcriptiereagens aan (pUTP, CAP GAG (3'OMe), pUTP, CAP GAG, N1-Me-pUTP, CAP GAG (3'OMe) en N1-Me-pUTP, CAP GRAP.
mRNA-zuivering
• Fenol: ChloroformExtraactie en Ethanol Neerslag
Voor het verwijderen van eiwitten en de meeste vrije nucleotiden is fenol:chloroformextractie en ethanolprecipitatie van RNA-transcripten de voorkeursmethode.
1. Pas het reactievolume aan tot 180 μl door 160 μl nucleasevrij water toe te voegen.Voeg 20 μl 3M natriumacetaat, pH 5,2 toe, meng grondig.
2. Extraheer met een gelijk volume 1:1 fenol/chloroformmengsel, centrifugeer gedurende 5 minuten bij 10.000 rpm.Verzamel de waterige fase en breng deze over naar een nieuwe buis.
3. Gevolgd door twee extracties met een gelijk volume chloroform.Verzamel de waterige fase en breng deze over naar een nieuwe buis.
4. Het RNA werd geprecipiteerd met 2 volumes ethanol.Incubeer bij -20℃ gedurende minimaal 30 minuten en verzamel de pallet door gedurende 15 minuten te centrifugeren.Verwijder voorzichtig het supernatant.
5. Spoel de pallet af met 150 μL~200 μL koude 70% ethanol.
6. Droog de pallet gedurende 2 minuten aan de lucht en suspendeer hem opnieuw in 100 μl~200 μl RNase-vrij water of andere buffers.
• LiCl-neerslag
LiCl-precipitatie van RNA is effectief bij het verwijderen van de meerderheid van niet-opgenomen NTP's en enzymen.
1. Voeg een gelijk volume LiCl-oplossing (5M) toe en meng goed.
2. Incubeer gedurende minimaal 30 minuten bij -20℃.Centrifugeer bij 4℃ en 12.000 rpm gedurende 15 minuten om het RNA op een pallet te plaatsen.Verwijder voorzichtig het supernatant.
3. Hars de pallet door 200 μl voorkoeling van 70% ethanol toe te voegen.Verwijder voorzichtig de ethanol.Herhaal de stappen 2 tot 3 keer.
4. Droog de pallet gedurende 5~10 minuten aan de lucht en suspendeer hem opnieuw in 100 μL~200 μL RNase-vrij water of andere buffers.
• Draaien kolomzuivering
Spinkolommen verwijderen niet-opgenomen NTP's, eiwitten en zouten.
• Magnetische kraal purificatie
Zuivering met magnetische kralen kan niet-opgenomen nucleotiden, eiwitten en zouten verwijderen.
Kwantificering van reactieproducten
• Kwantificering door UV lichtabsorptie: De reactieproducten moeten worden gezuiverd omdat eventuele niet-opgenomen nucleotiden en template-DNA in de reactiemengsels de aflezing zullen beïnvloeden.Door de UV-spectrofotometrie bij 260 nm te meten, kan gemakkelijk de RNA-concentratie worden verkregen.Voor enkelstrengs RNA komt 1 A260 overeen met een RNA-concentratie van 40 μg/ml.
• Kwantificering by kleurstof: Kwantificering van de reactieproducten kan zonder zuivering met Ribogreen-kleurstof worden gebruikt, omdat niet-opgenomen nucleotiden de evaluatie van RNA-producten niet zullen beïnvloeden.
Opmerkingen
• De transcriptiereactie moet worden uitgevoerd in een RNase-vrije omgeving.Het dragen van handschoenen is raadzaam.De tips, buizen en water moeten nucleasevrij zijn.
• Alle optimale eindconcentraties van NTP's zijn 10 mM, en u kunt de eindconcentratie van NTP's wijzigen op basis van de werkelijke toestand.
• Het RNA-synthesereactiemengsel moet bij kamertemperatuur worden bereid, omdat DNA bij 4°C kan neerslaan in de aanwezigheid van spermidine.
• De opbrengst aan transcripten met de juiste lengte neemt af als het template-DNA onvolledig gelineariseerd is.
• Het reactiemengsel kan worden opgeschaald of verkleind.
• Meng de buffer vóór gebruik totdat de onoplosbare stoffen volledig zijn opgelost, als na het opnieuw smelten blijkt dat de buffer onoplosbare stoffen bevat.
• Voor reacties met transcripten korter dan 300 bp zou een incubatie van 4-8 uur bij 37 ℃ een hogere opbrengst moeten opleveren.
• Het DNA-sjabloon dat wordt gebruikt voor standaard RNA-synthesetranscripten moet een T7-promotersequentie bevatten, gevolgd door een GGG-initiatiesequentie, omdat T7-RNA-polymerase een hogere affiniteit voor GTP heeft.
• De DNA-template die wordt gebruikt voor de mRNA-synthese met co-transcriptiesysteem moet een T7-promotersequentie bevatten, gevolgd door een AGG-initiatiesequentie.
Probleemoplossen
a) Lage opbrengst van full-lensgth-RNA:
Als de transcriptiereactie RNA van volledige lengte genereert, maar de opbrengst aanzienlijk lager is dan verwacht, is het mogelijk dat verontreinigingen in de DNA-sjabloon het RNA-polymerase remmen, of dat de DNA-concentratie te laag of onjuist is.
Suggestie: Aanvullende zuivering van de DNA-sjabloon wordt aanbevolen.
b) RNA vertaling aansmeren denattijdens Gel:
Als het RNA bij denaturerende agarose- of polyacrylamidegel afgebroken lijkt te zijn, is het DNA-sjabloon of het experimentproces besmet met RNase.
Suggestie: Als de plasmide-DNA-sjabloon verontreinigd is met RNase, voer dan een fenol/chloroform-extractie uit en laat ethanol neerslaan.Zorg ervoor dat de tips en buisjes die tijdens het experiment worden gebruikt, RNase-vrij zijn.Draag een laboratoriumjas, masker en wegwerphandschoenen.
c) RNA afschrift van groter formaat dan verwacht:
Als het RNA-transcript op een denaturerende gel groter lijkt dan verwacht, kan het matrijsplasmide-DNA onvolledig worden verteerd.De aanwezigheid van sterke secundaire structuren kan ervoor zorgen dat het RNA-transcript niet volledig gedenatureerd is.
Suggestie: Controleer de sjabloon op volledige vertering. Als onverteerd plasmide wordt bevestigd, herhaal dan de vertering met restrictie-enzymen.Reduceer secundaire structuren van DNA-sjabloon in de fase van sequentieontwerp.
d) RNA vertaling van kleiner maat dan verwacht:
Als de denaturerende gelanalyse de aanwezigheid van kleinere banden aantoont dan de verwachte grootte, is dit hoogstwaarschijnlijk te wijten aan voortijdige beëindiging door het polymerase.Sommige sequenties die lijken op T7-RNA-polymerase-terminatiesignalen zullen voortijdige terminatie veroorzaken.
Suggestie: Het incuberen van de transcriptiereactie bij lagere temperaturen, bijvoorbeeld bij 30°C, kan het aandeel van het transcript met de volledige lengte vergroten, maar de opbrengst zal afnemen.Voor GC-rijke templates, of templates met secundaire structuren, kan incubatie bij 42°C de opbrengst van transcripten met de volledige lengte verbeteren.
