Uracil DNA-glycosylase
Uracil-DNA-glycosylase (UNG of UDG) is een recombinante kloon van E.coli met een molecuulgewicht van 25 kDa.Het katalyseert de afgifte van vrij uracil uit uracilhoudend enkelstrengs en dubbelstrengs DNA, is inactief tegen RNA en kan worden gebruikt om besmetting van PCR-amplificatieproducten te voorkomen.Het werkingsprincipe is gebaseerd op het feit dat als dUTP wordt vervangen door dTTP in de PCR-reactie en er een PCR-amplificatieproduct wordt gevormd dat dU-basen bevat, het enzym selectief de glycosidische binding van U-basen in enkelstrengs en dubbelstrengs kan verbreken. DNA en breekt het PCR-amplificatieproduct af.
Aanbevolen toepassing
Versterking van besmettingspreventie
Opslag condities
-20°C voor langdurige opslag, goed mengen vóór gebruik, veelvuldig invriezen en ontdooien vermijden.
Opslagbuffer
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, stabilisator, 50% glycerol.
Eenheidsdefinitie
De hoeveelheid enzym die nodig is om 1 µg enkelstrengs DNA dat dU-basen bevat, in 1 uur bij 37°C af te breken, is 1 eenheid.
Kwaliteitscontrole
1.SDS-PAGE elektroforetische zuiverheid groter dan 98%
2.Versterkingsgevoeligheid, batch-tot-batch-controle, stabiliteit
3.Nadat 1U UNG gedurende 2 minuten bij 50℃ is behandeld, zou het sjabloon met minder dan 103 kopieën volledig moeten zijn afgebroken en kan er geen amplificatieproduct worden geproduceerd
4.Geen exogene nuclease-activiteit
Instructies
| Componenten | Volume (μl) | Eindconcentratie |
| 10 × PCR-buffer (dNTP-vrij, Mg²+vrij) | 5 | 1× |
| dUTP's (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (vervangt dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μl | 1-4 mM |
| 5 E/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × PrimermixA | 2 | 1× |
| Sjabloon | - | <1μg/reactie |
| ddH₂O | Tot 50 | - |
Opmerking: a: Indien gebruikt voor qPCR/qRT-PCR, moet de fluorescerende probe aan het reactiesysteem worden toegevoegd.Gewoonlijk kan een uiteindelijke primerconcentratie van 0,2 μM goede resultaten opleveren;wanneer de reactieprestaties slecht zijn, kan de primerconcentratie worden aangepast binnen het bereik van 0,2-1 μM.Gewoonlijk wordt de sondeconcentratie geoptimaliseerd in het bereik van 0,1-0,3 μM.Concentratiegradiëntexperimenten kunnen worden uitgevoerd om de beste combinatie van primer en probe te vinden.
Opmerkingen
1.UNG-enzym kan worden gebruikt om de verontreinigde dUTP-amplificatieproducten uit het reactiesysteem te verwijderen vóór de PCR-amplificatiereactie, en vervolgens om vals-positieve resultaten als gevolg van productcontaminatie te voorkomen.
2.De optimale temperatuur voor het UNG-enzym dat moet worden gebruikt in de anti-besmettings-PCR-reactie is over het algemeen 50 ℃ gedurende 2 minuten;de inactiveringstoestand is 95 ℃ gedurende 5 minuten.
3.Vermijd veelvuldig bevriezen en ontdooien en stel niet bloot aan grote temperatuurschommelingen.
4.Verschillende te versterken genen hebben een verschillende benuttingsefficiëntie van dUTP en gevoeligheid voor het UNG-enzym. Als het gebruik van het UNG-systeem leidt tot een afname van de detectiegevoeligheid, moet het reactiesysteem daarom worden aangepast en geoptimaliseerd. Als u technische ondersteuning nodig heeft, neem dan contact op met ons bedrijf.
