RTL Reverse Transcriptase
RTL reverse transcriptase is een RNA-template-afhankelijk DNA-polymerase dat de 3' → 5'-exonuclease-activiteit mist en RNase H-activiteit heeft.Dit enzym kan RNA als matrijs gebruiken om een complementaire DNA-streng te synthetiseren, die kan worden toegepast op de synthese van de eerste streng cDNA, vooral voor RT-LAMP (loop-gemedieerde isothermische amplificatie).Vergeleken met RTL reverse transcriptase 1.0 is de gevoeligheid aanzienlijk verbeterd, is de thermische stabiliteit sterker en is de reactie bij 65°C stabieler.RTL reverse transcriptase (glycerolvrij) kan worden gebruikt voor het bereiden van gelyofiliseerde preparaten, gelyofiliseerde RT-LAMP-reagentia enz.
Eenheidsdefinitie
Eén eenheid integreert 1 nmol dTTP in zuurprecipiteerbaar materiaal in 20 minuten bij 50°C met behulp van poly(A)·oligo(dT)25 als template-primer.
Componenten
| Onderdeel | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Reverse Transcriptase (Glycerolvrij) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL-buffer | 1,5 ml | 4×1,5 ml | 5×10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2×1,5 ml | 3×10 ml |
Opslag condities
Transport onder 0°C en opgeslagen bij -25°C~-15°C.
Kwaliteitscontrole
- Restactiviteit vanEndonuclease:Een reactie van 50 μl met 1 μg λDNA en 15 eenheden RTL2.0, geïncubeerd gedurende 16 uur bij 37 ℃, vertoont hetzelfde patroon als de negatieve controle door gelelektroforese.
- Restactiviteit vanExonuclease:Een reactie van 50 μl met 1 μg Hind Ⅲ gedigereerd λDNA en 15 eenheden RTL2.0 geïncubeerd gedurende 16 uur bij 37 ℃ vertoont hetzelfde patroon als negatieve controle door gelelektroforese.
- Restactiviteit vanNickase:Een reactie van 50 μl met 1 μg supercoiled pBR322 en 15 eenheden RTL2.0 geïncubeerd gedurende 4 uur bij 37°C vertoont hetzelfde patroon als de negatieve controle door gelelektroforese.
- Restactiviteit vanRNase:Een reactie van 10 μl met 0,48 μg MS2-RNA en 15 eenheden RTL2.0, geïncubeerd gedurende 4 uur bij 37 °C, vertoont hetzelfde patroon als de negatieve controle door gelelektroforese.
- E coli gDNA:Gemeten metE colispecifieke HCD-detectiekits, 15 eenheden RTL2.0 bevatten minder dan 1E coligenoom.
Reactie-opstelling
cDNA-syntheseprotocol
| Componenten | Volume |
| Sjabloon-RNA a | optioneel |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) of willekeurige primermix (60uM) | 2 μl |
| dNTP-mix (elk 10 mM) | 1 μl |
| RNase-remmer (40U/uL) | 0,5 μl |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0,5 μl |
| 10×HC RTL-buffer | 2 μl |
| Nucleasevrij water | Tot 20 μl |
Opmerkingen:
1) De aanbevolen dosering Totaal RNA is 1ng~1μg
2) De aanbevolen dosering mRNA was 50 ng ~ 100 ng
Thermo-fietsen Voorwaarden voor een routine reactie:
| Temperatuur (°C) | Tijd |
| 25 °Ca | 5 mins |
| 55 °C | 10 minutenb |
| 80 °C | 10 minuten |
Opmerkingen:
1) Als Random Primer Mix wordt gebruikt, een incubatiestap bij 25°C.
2) Als het doelprimermengsel wordt gebruikt, een incubatiestap bij 55°C gedurende 10~30 minuten.
RT-LAMP-protocol
| Componenten | Volume | Laatste concentratie |
| Sjabloon-RNA | optioneel | ≥10 exemplaren |
| dNTP-mix (10 mM) | 3,5 μl | 1,4 mM |
| FIP/BIP-primers (25×) | 1 μl | 1,6 μM |
| F3/B3-primers (25×) | 1 μl | 0,2 μM |
| LoopF/LoopB-primers (25×) | 1 μl | 0,4 μM |
| RNase-remmer (40U/μl) | 0,5 μl | 20 U/reactie |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0,5 μl | 7,5 E/reactie |
| Bst V2 DNA-polymerase (8U/μL) | 1 μl | 8 U/reactie |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μl | 6 mM (totaal 8 mM) |
| 10×HC RTL-buffer (of 10×HC Bst V2-buffer) | 2,5 μl | 1 × (2 mM Mg2+) |
| Nucleasevrij water | Tot 25 μl | - |
Opmerkingen:
1) Meng door vortexen en centrifugeer kort om te verzamelen.Incubatie bij constante temperatuur bij 65°C gedurende 1 uur.
2) De twee buffers zijn interoperabel en hebben dezelfde samenstelling.
Opmerkingen
1. Dit product vormt een witte vaste stof wanneer het bij -20 °C wordt bewaard.Haal het van -20°C en plaats het ongeveer 10 minuten op ijs.Na het smelten kan het worden gebruikt door te schudden en te mengen.
2. Het cDNA-product kan worden bewaard bij -20°C of -80°C of onmiddellijk worden gebruikt voor PCR-reactie.
3. Om RNase-besmetting te voorkomen, moet u het experimentele gebied schoon houden en tijdens het gebruik schone handschoenen en maskers dragen.
