Plant directe PCR-kit
Cat.nr.: HCR2020A
Plant Direct PCR Kit is geschikt voor directe amplificatie van plantenbladeren, zaden, enz., en kan worden gebruikt voor high-throughput screening van plantenmonsters die geen polysachariden en polyfenolen bevatten.Het directe amplificatie-DNA-polymerase op basis van de gerichte evolutie heeft een superieure tolerantie voor PCR-remmers in planten.Ondertussen behoudt het de hoge amplificatieprestaties, die geschikt zijn voor de amplificatie van DNA-fragmenten binnen 5 kb.De unieke Lysisbuffer A in de kit kan worden gebruikt om vers of bevroren plantenweefsel te lyseren.Het is eenvoudig te bedienen en het lysaat kan zonder zuivering als sjabloon voor amplificatie worden gebruikt.Het systeem bevat beschermende middelen waarmee ruwe monsters na herhaald invriezen en ontdooien effectief kunnen worden geamplificeerd.2 × Plant Direct Master Mix hoeft alleen maar primers en sjablonen toe te voegen om een amplificatiereactie uit te voeren, waardoor de pipetteerwerkzaamheden worden verminderd en de detectiedoorvoer en reproduceerbaarheid van de resultaten worden verbeterd.
Componenten
| Componenten | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Plant Direct Mastermix | 1,25 ml | 4×1,25 ml |
| Plant Directe Lysisbuffer A | 5 ml | 20 ml |
| Plant Directe Lysisbuffer B* | 5 ml | 20 ml |
*Plant Direct Lysis Buffer B is een optioneel reagens dat wordt gebruikt om Plant Direct Lysis Buffer A te neutraliseren om de opslagtijd van monsters te verlengen.Het kan worden gebruikt volgens de werkelijke situatie.
Opslag condities
2 × Plant Direct Master Mix, bewaren bij -30 ~ -15℃ en vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien;Plant Direct Lysis Buffer, bewaar bij -30 ~ -15℃ of 2 ~ 8℃.
Experimenteer proces
Monsterverwerking–Plantenblad
Directe methode:Het wordt aanbevolen om jonge bladeren te gebruiken.Gebruik een perforator met een vaste diameter van 0,5 – 3 mm om een klein en uniform monster te verkrijgen en voeg het monster vervolgens direct toe aan het PCR-systeem (50 μl-systeem wordt aanbevolen).Let op: zorg ervoor dat het monster zich in de PCR-oplossing bevindt en niet tegen de buiswand.Als directe PCR wordt gebruikt om lange fragmenten en complexe monsters te amplificeren, kan het gebruik van een monster met een kleinere diameter (0,5 – 1 mm) als sjabloon helpen om betere resultaten te verkrijgen.
Malen lysis methode:Het wordt aanbevolen om jonge bladeren te gebruiken.Neem een klein stukje blad (ongeveer 1 – 3 mm in diameter), plaats het in 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab en vermaal het zo veel mogelijk (deze stap kan worden gedaan door in het blad te knijpen met een pipetpunt van 100 μl om het monster te pureren).Als grotere volumes bladweefsel worden gebruikt (niet groter dan 7 mm), verhoog dan het volume van de verdunningsbuffer tot 50 μl.Nadat de bladeren zijn gemalen, moet de oplossing groen lijken.Voeg na een korte centrifugatie 1 μl van het supernatant toe aan het PCR-systeem als reactiesjabloonc.
Thermische lysemethode:Het wordt aanbevolen om jonge bladeren te gebruiken.Neem een klein stukje blad (ongeveer 1 – 3 mm in diameter), plaats het in 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A en verwarm het gedurende 5 – 10 minuten op 95°C.De lysetijd kan op passende wijze worden verlengd voor bladeren die moeilijk te lyseren zijn (niet meer dan 20 minuten).Als grotere volumes bladweefsel worden gebruikt (niet groter dan 7 mm), verhoog dan het volume van de verdunningsbuffer tot 50 μl.Centrifugeer na verwarming kort en voeg 1 μl supernatant toe aan het PCR-systeem als reactiesjabloonb.
Monsterverwerking– Plantenzaad
Malen lysis methode:Gebruik een scalpel om zaden met een diameter van 5 mm te snijden, voeg ze toe aan 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A en maal het monster met een pipetpunt of ander gereedschap.Vortex kort en laat 3 – 5 minuten bij kamertemperatuur staan.Zorg ervoor dat het zaadmonster is ondergedompeld in de verdunningsbuffer.Voeg na een korte centrifugatie 1 μl van het supernatant toe aan het PCR-systeem als reactiesjabloon.
Thermische lysemethode:Gebruik een scalpel om zaden met een diameter van 5 mm te snijden, voeg ze toe aan 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A en verwarm gedurende 5 – 10 minuten bij 95°C.De lysetijd kan op passende wijze worden verlengd voor bladeren die moeilijk te lyseren zijn (niet meer dan 30 minuten).Centrifugeer na verwarming kort en voeg 1 μl supernatant toe aan het PCR-systeem als reactiesjabloonb.
A.Een schaar of ander gereedschap kan ook worden gebruikt om monsters van geschikte grootte te knippen;Als de pons of schaar opnieuw wordt gebruikt, moet deze vóór elk gebruik worden gereinigd met een 2% natriumhypochlorietoplossing om kruisbesmetting tussen monsters te voorkomen.
B.Zorg ervoor dat de Plant Direct Lysis Buffer vóór gebruik volledig is gesmolten.Als de buffer stroperig is of neerslag bevat, kan deze vóór gebruik worden verwarmd tot 37 ℃ om deze volledig te smelten.
C.Het volume template in het reactiesysteem kan op passende wijze worden aangepast afhankelijk van het verschil in het toegevoegde volume plantaardig materiaal en verdunningsmiddel.
Plant Directe Lysisbuffer
De Plant Direct Lysis Buffer A in dit product is strikt geoptimaliseerd om het genoom van de meeste plantenweefsels vrij te geven en is geschikt voor korte termijn opslag van ruwe planten bij 4℃.Als het monster voor langere tijd moet worden bewaard (bijvoorbeeld 1 – 2 maanden), wordt aanbevolen om het supernatant over te brengen naar een nieuwe EP-buis en deze op te slaan bij -20 ℃.Om de monsters stabieler op te slaan, voegt u een gelijk volume Plant Direct Lysis Buffer B toe aan de overgebrachte supernatant, mengt u goed en bewaart u deze bij -20℃.De stabiele opslagtijd varieert afhankelijk van de plantenmonsters en -toestanden.
Reactiesysteem
| ddH2O | Tot 20,0 µl | Tot 50,0 µl |
| 2 × Plant Direct Mastermixa | 10,0 µl | 25,0 µm |
| Primer 1 (10 µM) | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Primer 2 (10 µM)b | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Monster van plantenblad/ruw extract(Zie Monsterverwerking) | Bladschijf van 0,5 – 3 mm/x µl | Bladschijf van 0,5 – 3 mm/x µl |
A.Het bevat mg2+bij een eindconcentratie van 2 mM.
B.Het wordt aanbevolen om voor elke primer een eindconcentratie van 0,4 μM te gebruiken.Overmatig gebruik van primers zal leiden tot verhoogde niet-specifieke amplificatie.
C.De hoeveelheid gebruikt monster kan worden aangepast aan de werkelijke situatie.De hoeveelheid die in een enkele reactie van het ruwe gelyseerde monster wordt gebruikt, kan worden aangepast tussen 2% en 20% van het totale volume van de reactie.Als u te veel monsters gebruikt, kan de amplificatie mislukken.
Reactieprogramma
| Stappen | Temperatuur | Tijd |
| Initiële denaturatie | 98℃ | 5 minuten |
| Denaturatie | 95℃ | 10 sec |
| Gloeien | 58 ~ 72℃ | 15 sec |
| Verlenging | 72℃ | 30 sec |
| Laatste verlenging | 72℃ | 5 minuten |
A.Initiële denaturatie (98℃, 5 min) bevordert de lysis van plantenweefsel, waardoor genomisch DNA vrijkomt dat kan worden gebruikt voor PCR-amplificatie.Verkort de tijd niet en verlaag de temperatuur niet.
B.Het wordt aanbevolen om deze gelijk te stellen aan de primer-Tm-waarde of 2 ~ 4℃ hoger dan de Tm-waarde.Het directe amplificatie-DNA-polymerase dat in dit product wordt gebruikt, verschilt van conventioneel Taq DNA-polymerase en stelt speciale eisen aan de reactie-ontlatingstemperatuur; het gebruik van een hoge ontlatingstemperatuur kan niet-specifieke amplificatie effectief verminderen en de amplificatie-efficiëntie verbeteren.Voor complexe templates kan de efficiënte amplificatie worden bereikt door de uitgloeitemperatuur aan te passen en de verlengingstijd te verlengen.
C.Als de lengte van het amplificatieproduct ≤1 kb is, wordt de verlengingstijd ingesteld op 30 sec/kb;als de lengte van het amplificatieproduct >1 kb is, wordt de verlengingstijd ingesteld op 60 sec/kb.
D.Voor complexe monsters of monsters met een lage amplificatieopbrengst kan het aantal cycli op passende wijze worden verhoogd tot 40-50 cycli.
Toepassingen
Het is toepasbaar voor directe amplificatie van plantenweefsels en screening met hoge doorvoer van plantenmonsters die geen polysachariden en polyfenolen bevatten.
Opmerkingen
Alleen voor onderzoeksgebruik.Niet voor gebruik bij diagnostische procedures.
1. Voor amplificatie van ruwe planten of directe amplificatie wordt aanbevolen om gezuiverd genomisch DNA als positieve controle te gebruiken voordat u met het experiment begint, om er zeker van te zijn dat het systeem, de primers en de handelingen correct zijn.
2. Het directe amplificatie-DNA-polymerase dat in deze kit wordt gebruikt, heeft een sterke proefleesactiviteit.Als TA-klonering moet worden uitgevoerd, wordt aanbevolen het DNA te zuiveren voordat de adenine wordt toegevoegd.
3. Richtlijnen voor het ontwerpen van primers:
A.Het wordt aanbevolen dat de laatste base aan het 3'-uiteinde van de primer G of C is.
B.Opeenvolgende mismatches moeten worden vermeden in de laatste 8 basen aan het 3'-uiteinde van de primer.C.Vermijd haarspeldstructuren aan het 3’-uiteinde van de primer.
D.Verschillen in de Tm-waarde van de forward primer en de reverse primer mogen niet groter zijn dan 1℃ en de Tm-waarde moet worden aangepast naar 60 ~ 72℃ (Primer Premier 5 wordt aanbevolen om de Tm-waarde te berekenen).
e.Extra extra primersequenties die niet overeenkomen met de template, mogen niet worden meegenomen bij het berekenen van de primer Tm-waarde.
F.Het wordt aanbevolen dat het GC-gehalte van de primer 40% -60% bedraagt.
G.De algehele verdeling van A, G, C en T in de primer moet zo gelijkmatig mogelijk zijn.Vermijd het gebruik van regio's met een hoog GC- of AT-gehalte.
H.Vermijd de aanwezigheid van complementaire sequenties van 5 of meer basen, hetzij binnen de primer, hetzij tussen twee primers, en vermijd de aanwezigheid van complementaire sequenties van 3 of meer basen aan het 3'-uiteinde van twee primers.
i.Gebruik de NCBI BLAST-functie om de specificiteit van de primer te controleren om niet-specifieke amplificatie te voorkomen.
