Proteïnase K NGS (poeder)

Specificatie

Eigenschappen

Eenheidsdefinitie

Eén eenheid NGS-protease K wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om caseïne te hydrolyseren tot 1 μmol L-tyrosine onder standaard bepalingsomstandigheden.

 Bereiding van reagentia

Reagens I:

Substraat: 1% caseïne uit rundermelkoplossing: los 1 g rundermelkcaseïne op in 50 ml 0,1 M natriumfosfaatoplossing, pH 8,0, verwarm gedurende 15 minuten in een waterbad op 65-70 °C, roer en los op, koel af met water, aangepast met natriumhydroxide tot pH 8,0 en verdun tot 100 ml.

Reagens II:

TCA-oplossing: 0,1 M trichloorazijnzuur, 0,2 M natriumacetaat en 0,3 M azijnzuur (weeg achtereenvolgens 1,64 g trichloorazijnzuur + 1,64 g natriumacetaat + 1,724 ml azijnzuur, voeg 50 ml gedeïoniseerd water toe, pas met HCl aan tot pH 4,03 en verdun in 100 ml).

Reagens III:

0,4 ml natriumcarbonaatoplossing (weeg 4,24 g watervrij natriumcarbonaat af en los op in 100 ml water)

Reagens IV:

Folinfenolreagens: 5 keer verdunnen met gedeïoniseerd water.

Reagens V:

Enzymverdunningsmiddel: 0,1 M natriumfosfaatoplossing, pH 8,0.

Reagens VI:

L-tyrosine standaardoplossing: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tyrosine opgelost met 0,2 M HCl.

Procedure

1. Schakel de UV-Vis-spectrofotometer in en selecteer fotometrische meting.

2. Stel de golflengte in op 660 nm.

3. Schakel het waterbad in, stel de temperatuur in op 37 ℃ en zorg ervoor dat de temperatuur gedurende 3-5 minuten onveranderd blijft.

4. Verwarm 0,5 ml substraat in een centrifugebuis van 2 ml gedurende 10 minuten op een waterbad van 37 ℃.

5. Extraheer 0,5 ml verdunde enzymoplossing gedurende 10 minuten in de voorverwarmde centrifugebuis.Stel het enzymverdunningsmiddel in als blanco groep.

6. Voeg onmiddellijk na de reactie 1,0 ml TCA-reagens toe.Meng goed en incubeer gedurende 30 minuten in een waterbad.