mRNA Cap2'-O-methyltransferase

mRNA Cap 2'-O-methyltransferase werd afgeleid van een recombinante E. coli-stam die het gen voor het vaccinia-mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase draagt.Dit enzym voegt een methylgroep toe op de 2´-O-positie van het eerste nucleotide grenzend aan de cap-structuur aan het 5´-uiteinde van het RNA. Het enzym gebruikt S-adenosylmethionine (SAM) als een methyldonor om gecapteerd RNA (cap) te methyleren. -0) resulterend in een cap-1-structuur.

De Cap1-structuur kan de translatie-efficiëntie verhogen, waardoor de expressie van mRNA in transfectie- en micro-injectie-experimenten wordt verbeterd. Dit enzym vereist specifiek RNA met een m7GpppN-cap als substraat.Het kan geen gebruik maken van RNA met pN, ppN, pppN of GpppN aan het 5'-uiteinde.Capped RNA kan worden bereid via in vitro transcriptie met behulp van cap-analoog of via enzymatische capping met behulp van het Vaccinia Capping Enzyme.

Componenten

mRNA-dop 2´-O-methyltransferase (50U/μL)

10 × Capping-reactiebuffer

Opslag

-25 ~- 15℃ voor opslag (Vermijd herhaalde vries-dooicycli)

Opslagbuffer

20 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0, 1 mM EDTA, 0, 1% Triton X-100, 50% glycerol.

Eenheidsdefinitie

Eén eenheid wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om 10 pmol 80nt-gecapped RNA-transcript in 1 uur bij 37°C te methyleren.

Kwaliteitscontroletests

Exonuclease:50U mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase met 1μg λ-Hind III verteert DNA bij 37 ℃ gedurende 16 uur levert geen afbraak op, zoals bepaald door agarosegelelektroforese.

Endonuclease: 50 U mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase met 1 μg λDNA bij 37℃ gedurende 16 uur levert geen afbraak op zoals bepaald door agarosegelelektroforese.

Nickase: 50U mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase met 1μg pBR322 bij 37 ℃ gedurende 16 uur levert geen afbraak op zoals bepaald door agarosegelelektroforese.

RNase: 50U mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase met 1,6μg MS2 RNA gedurende 4 uur bij 37℃ levert geen afbraak op zoals bepaald door agarosegelelektroforese.

E. coli DNA: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase wordt gescreend op de aanwezigheid vanE. coli genomisch DNA met behulp van TaqMan qPCR met primers die specifiek zijn voor deE. coli 16S rRNA-locus.DeE. coli genomische DNA-besmetting is =1E. coli genoom.

Bacterieel Endotoxine: LAL-test, volgens Chinese Farmacopee IV editie 2020, gellimiettestmethode, algemene regel (1143).Het bacteriële endotoxinegehalte moet = 10 EU/mg zijn.

Reactiesysteem en omstandigheden

1. Combineer een geschikte hoeveelheid afgedekt RNA en RNase-vrij H2O in een microfugebuisje van 1,5 ml tot een eindvolume van 16,0 µl.

2. Verwarm gedurende 5 minuten op 65℃, gevolgd door een ijsbad gedurende 5 minuten.

3. Voeg de volgende componenten toe in de aangegeven volgorde (voor methylering van Capped RNA

minder dan 10

*10× reactiebuffer met capping: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT.

4. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ℃ (2 uur incubatie wordt aanbevolen voor het doelfragment van minder dan 200 nt).

Toepassingen

Om de mRNA-expressie te verbeteren tijdens micro-injectie- en transfectie-experimenten.

Opmerkingen over gebruik

1. Vóór de reactie moet RNA worden gezuiverd en opgelost in nucleasevrij water. Alle oplossingen mogen geen EDTA en ionen bevatten.

2. Het wordt aanbevolen om het monster-RNA vóór de reactie 5 minuten op 65 ℃ te verwarmen om de secundaire structuur aan het 5'-uiteinde van het transcript te verwijderen.Het kan worden verlengd tot 10 minuten voor een complexe 5'-terminale structuur.