EndoFree Plasmid Maxi-kit
Deze kit is geschikt voor extractie uit 150 – 300 ml bacteriële oplossing die een nacht is gekweekt, met behulp van een verbeterde SDS-alkalische lysemethode om de bacteriën te lyseren.Het ruwe extract wordt selectief gecombineerd met een unieke Endotoxine-wegvanger en gescheiden door centrifugatie om endotoxinen te verwijderen.Vervolgens bindt het silicagelmembraan selectief aan plasmide-DNA in de oplossing onder omstandigheden met een hoog zoutgehalte en een lage pH.Dit wordt gevolgd door de toevoeging van wasbuffer om onzuiverheden en andere bacteriële componenten te verwijderen.Ten slotte wordt een elutiebuffer met een laag zoutgehalte en een hoge pH gebruikt om zuiver plasmide-DNA uit het siliciummatrixmembraan te elueren.Het silicagelmembraan maakt gebruik van een speciaal adsorptiemembraan en het verschil in adsorptiehoeveelheid tussen de kolom en de kolom is zeer klein en de herhaalbaarheid is goed.Fenol, chloroform en andere giftige reagentia zijn niet vereist, en ethanolprecipitatiestappen ook niet.Deze kit kan worden gebruikt om snel 0,2 - 1,5 mg puur plasmide-DNA met hoge kopieën te extraheren, met een extractiepercentage van 80% -90%.De kit maakt gebruik van een unieke procesformule die endotoxine verwijdert, het gehalte aan endotoxine is extreem laag en het celtransfectie-effect is uitstekend.Het geëxtraheerde plasmide zou direct kunnen worden gebruikt bij enzymdigestie, PCR, in vitro transcriptie, transformatie, sequencing en andere experimenten in de moleculaire biologie.
Opslag condities
RNaseA moet worden opgeslagen bij -30 ~ -15℃ en worden vervoerd bij ≤0℃.
Endotoxine Scavenger kan gedurende één maand bij 2 ~ 8℃ worden bewaard, en bij -30 ~ -15℃ voor langdurige opslagen vervoerd bij ≤0℃.
Andere componenten moeten bij kamertemperatuur (15 ~ 25 ℃) worden bewaard en bij kamertemperatuur worden vervoerd.
Componenten
| Componenten | 10RXNS |
| RNase A | 750 μl |
| Buffer P1 | 75 ml |
| Buffer P2 | 75 ml |
| Buffer P4 | 75 ml |
| Endotoxine-wegvanger | 25 ml |
| Buffer PW | 2 × 22 ml |
| Buffer-TB | 20 ml |
| FastPure DNA Maxi-kolommen (elk in een verzamelbuis van 50 ml) | 10 |
| Endotoxinevrije verzamelbuis | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, gebruikt om RNA te verwijderen.
Buffer P1:bacteriële suspensiebuffer, voeg vóór het eerste gebruik RNaseA toe aan buffer P1.
Buffer P2:bacteriële lysebuffer (die SDS/NaOH bevat).
Buffer P4:neutraliserende buffer.
Endotoxine-wegvanger:verwijdert effectief endotoxine uit het ruwe plasmide-extract.
Buffer PW:wasbuffer, voeg vóór het eerste gebruik het aangegeven volume ethanol toe.
Buffer-TB:elutiebuffer.
FastPure DNA Maxi-kolommen:plasmide-DNA-adsorptiekolommen.
Verzamelbuisjes 50 ml:filtraatopvangbuizen.
Endotoxinevrije verzamelbuis:plasmide-DNA-verzamelbuisjes.
Voorbereide materialen
Absolute ethanol, isopropanol, centrifugebuisjes met ronde bodem van 50 ml en 50 ml endotoxinevrijcentrifugeerbuizen.
Toepassingen
Dit product is geschikt voor grootschalige extractie van plasmiden uit 150 - 300 ml bacteriële oplossing's nachts gekweekt.
Experimenteer proces
1. Neem 150 – 200 ml (niet meer dan 300 ml) bacteriële oplossing, een nacht gekweekt en centrifugeerongeveer 11.000 tpm (12.000 × g) gedurende 1 – 2 minuten.Gooi het supernatant weg en verzamel bacteriën.
Δ Wanneer meer dan 50 ml bacteriële oplossing wordt verzameld, kunnen de bacteriën worden verzameld door bacteriële oplossing toe te voegen, te centrifugeren, het supernatant weg te gooien en andere stappen in hetzelfde buisje van 50 ml te doen.
meerdere keren.
2. Voeg 7,5 ml Buffer P1 toe (controleer of RNaseA aan Buffer P1 is toegevoegd) aan de centrifugebuisje met bacteriën en meng grondig door vortex of pipetteren.
Δ De volledige resuspensie van bacteriën in deze stap is van cruciaal belang voor de opbrengst, en er mogen na resuspensie geen bacteriële klonten ontstaan.Als er bacteriële klonten zijn die niet grondig worden gemengd, zal dit de lyse beïnvloeden, wat resulteert in een lage opbrengst en zuiverheid.Als de OD600 van de bacteriële oplossing 0,65 is, wordt aanbevolen 7,5 ml Buffer P1 te gebruiken bij extractie uit 150 ml bacteriële oplossing;wanneer OD600 0,75 is, moet 8 ml Buffer P1 worden gebruikt en moeten de volumes van Buffers P2 en P4 dienovereenkomstig worden gewijzigd.Als het volume van de bacteriële oplossing wordt verhoogd tot 200 ml, wordt aanbevolen dat devolume van buffers P1, P2 en P4 proportioneel worden vergroot.
3. Voeg 7,5 ml Buffer P2 toe aan de bacteriesuspensie uit stap 2 en meng voorzichtig op en neer gedurende 6 – 8 minuten.maal en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 4 – 5 minuten.
Δ Voorzichtig omkeren om grondig te mengen.Vortexen zal de genomische DNA-fragmentatie veroorzaken, resulterend in genomische DNA-fragmenten in het geëxtraheerde plasmide.Op dit moment wordt de oplossing stroperig en doorschijnend, wat aangeeft dat de bacteriën volledig zijn gelyseerd.De duur mag niet langer zijn dan 5 minuten om vernietiging van de plasmiden te voorkomen.Als de oplossing niet helder is, kunnen er teveel bacteriën ontstaanonvolledige lyse, dus de hoeveelheid bacteriën moet op passende wijze worden verminderd.
4. Voeg 7,5 ml Buffer P4 toe aan de bacteriesuspensie uit stap 3 en keer onmiddellijk voorzichtig 6 – 8 keer om, zodat de oplossing Buffer P2 volledig kan neutraliseren.Op dit moment zou er een wit uitvlokkend neerslag moeten verschijnen.Centrifugeer bij meer dan ongeveer 11.000 rpm (12.000 x g) gedurende 10 – 15 minuten, pipetteer het supernatant voorzichtig in een nieuwe 50 ml centrifugebuis met ronde bodem (zelf klaargemaakt) en vermijdZuig het drijvende witte neerslag op.
Δ Voeg Buffer P4 toe en keer onmiddellijk om om goed te mengen.Laat de buis staan totdat het witte neerslag gelijkmatig door de oplossing is verdeeld om de vorming van plaatselijke neerslag te voorkomen, wat de neutralisatie zou kunnen beïnvloeden.Als er vóór het centrifugeren geen uniform wit, uitvlokkend neerslag is en het supernatant na het centrifugeren niet helder is, kan het buisje wordennog 5 minuten gecentrifugeerd.
5. Voeg 0,1 keer het volume (10% van het volume van de supernatant, ongeveer 2,2 ml) Endotoxine Scavenger toe aan de supernatant uit stap 4 en keer om om te mengen.Plaats de oplossing in een ijsbad of plaats deze gedurende 5 minuten in gemalen ijs (of een koelkast met vriesvak) totdat de oplossing verandert van troebel naar helder en transparant (of stil).licht troebel), en af en toe meerdere keren mengen.
Δ Nadat de Endotoxinewegvanger aan het supernatant is toegevoegd, zal het supernatant troebel worden, maar deHet supernatant moet helder (of enigszins troebel) worden na afkoelen in het ijsbad.
6. Nadat het supernatant gedurende 10 – 15 minuten bij kamertemperatuur (>25℃) is geplaatst, wordt het troebel alsde temperatuur stijgt tot kamertemperatuur.Vervolgens moet het supernatans worden omgekeerd om te mengen.
Δ Als de kamertemperatuur lager is of als u de extractietijd wilt verkorten, kan het supernatant gedurende 5 – 10 minuten worden geïncubeerd in een waterbad van 37 ~ 42 ℃ en kan de volgende stap worden uitgevoerd nadat het supernatant is verwijderd.wordt troebel.
7. Centrifugeer het supernatant gedurende 10 minuten bij ongeveer 11.000 rpm (12.000 x g) bij kamertemperatuur (de temperatuur moet >25℃ zijn) om de fase te scheiden.De bovenste waterige fase bevat het DNA, terwijl de onderste blauwe olieachtige faselaag endotoxine en andere onzuiverheden bevat.Breng de overDNA-bevattende waterige fase naar een nieuw buisje engooi de olieachtige laag weg.
Δ De temperatuur tijdens het centrifugeren moet hoger zijn dan 25℃, omdat dit niet het geval is bij effectieve fasescheidingoptreden als de temperatuur te laag is.
Δ Als de fasescheiding niet effectief is, kan de centrifugatietemperatuur worden aangepast tot 30℃ ende centrifugatietijd kan worden verhoogd tot 15 minuten.
Δ Zuig niet op de blauwe olieachtige laag, aangezien deze endotoxine en andere onzuiverheden bevat.
Mechanisme
Resuspensie Lysis Neutralisatie
◇ Voeg 7,5 ml buffer P1 toe
◇ Voeg 7,5 ml Buffer P2 toe
◇ Voeg 7,5 ml buffer P4 toe
Verwijdering van endotoxinen
◇Voeg 0,1 keer het supernatantvolume Endotoxine Scavenger toe
Binden en wassen
◇ Voeg 0,5 keer het volume isopropanol toe
◇ Voeg 10 ml Buffer PW toe
◇ Voeg 10 ml Buffer PW toe
Elutie
◇ Voeg 1 – 2 ml Buffer TB of Endotoxinevrij ddH2O toe
