Dubbelstrengs RNA (dsRNA) ELISA-KIT

Deze kit is een Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) die is gekoppeld aan een biotine-streptavidinesysteem, voor kwantitatieve meting van dsRNA met een lengte boven 60 basenparen (bp), ongeacht de sequentie.De plaat is vooraf gecoat met anti-dsRNA-antilichaam.dsRNA dat in het monster aanwezig is, wordt toegevoegd en bindt aan antilichamen die op de putjes zijn gecoat.En vervolgens wordt gebiotinyleerd anti-dsRNA-antilichaam toegevoegd en bindt het aan dsRNA in het monster.Na het wassen wordt HRP-Streptavidine toegevoegd en bindt het aan het gebiotinyleerde anti-dsRNA-antilichaam.Na incubatie wordt ongebonden HRP-Streptavidine weggewassen.Vervolgens wordt de TMB-substraatoplossing toegevoegd en gekatalyseerd door HRP om een ​​blauw kleurproduct te produceren dat in geel veranderde na toevoeging van een zure stopoplossing.De dichtheid van geel is evenredig met de beoogde hoeveelheid dsRNA die in de plaat wordt gevangen.De absorptie wordt gemeten bij 450 nm.

Sollicitatie

Deze kit is bedoeld voor kwantitatieve meting van resterend dsRNA.

Kit-componenten

Opslag en stabiliteit

1. Voor ongebruikte kit: De hele kit kan bij een houdbaarheid van 2~8℃ worden bewaard.Sterk licht moet worden vermeden vanwege de stabiliteit bij opslag.

2. Voor gebruikte kit: zodra de microtiterplaat is geopend, bedek de ongebruikte wells met plaatafdichtmiddel en plaats deze terug in het foliezakje met het droogmiddelpakket, sluit het foliezakje af met een ritssluiting en plaats het zo snel mogelijk na gebruik terug op 2~8℃.Andere reagentia moeten zo snel mogelijk na gebruik worden teruggebracht naar 2~8℃.

Benodigde, maar niet meegeleverde materialen

1. Microplaatlezer met 450 ± 10 nm filter (beter als deze kan detecteren bij een golflengte van 450 en 650 nm).

2. Schudapparaat voor microplaten.

3. RNase-vrije tips en centrifugebuisjes.

Bediening stroomschema

Voordat je begint

1. Breng vóór gebruik alle kitcomponenten en monsters op kamertemperatuur (18-25℃).Als de kit niet in één keer wordt opgebruikt, verwijder dan alleen de strips en reagentia voor het huidige experiment en laat de resterende strips en reagentia in de juiste staat.

2. Wasbuffer: verdun 40 ml 20× geconcentreerde wasbuffer met 760 ml gedeïoniseerd of gedestilleerd water om 800 ml 1× wasbuffer te bereiden.

3. Standaard: de stockoplossing kort centrifugeren of centrifugeren vóór gebruik.De concentratie van de vier geleverde standaarden is 5ng/μl.Voor UTP- en pUTP-dsRNA-standaarden dient u de stockoplossing met STE-buffer te verdunnen tot 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0pg/μL om de standaardcurve te tekenen.Voor N1-Me-pUTP dsRNA-standaarden dient u de stockoplossing te verdunnen tot 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0pg/μL met STE-buffer om de standaardcurve te tekenen.Voor de 5-OMe-UTP dsRNA-standaard dient u de stockoplossing met STE-buffer te verdunnen tot 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0pg/μL om de standaardcurve te tekenen.Wij raden aan dat standaarden kunnen worden verdund als volgt:

4. Werkoplossing van gebiotinyleerd detectie-antilichaam en HRP-streptavidine: de stockoplossing vóór gebruik kort centrifugeren of centrifugeren.Verdun ze tot de werkconcentratie met verdunningsbuffer.

5. TMB-substaat: zuig de benodigde dosering van de oplossing op met gesteriliseerde tips en gooi de resterende oplossing niet opnieuw in de injectieflacon.TMB-substaat is gevoelig voor licht, stel TMB-substraat niet langdurig bloot aan licht.

Protocol gebruiken

1. Bepaal het aantal strips dat nodig is voor de test.Plaats de strips in de frames voor gebruik.De resterende plaatstrips die niet bij deze test worden gebruikt, moeten opnieuw in de zak met droogmiddel worden verpakt.Sluit de zak goed af voor gekoelde opslag.

2. Voeg 100 μl verdunningen van standaard, blanco en monsters toe aan de juiste wells.Bedek met de plaatafdichter.Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder schudden bij 500 rpm.Voor een nauwkeurige analyse moeten de monsters worden verdund met STE-buffer tot de juiste concentratie.

3. Wasstap: Zuig de oplossing op en was met 250 μl wasbuffer in elk putje en laat dit gedurende 30 seconden staan.Gooi de wasbuffer volledig weg door de plaat op absorberend papier te klikken.Totaal 4 keer wassen.

4. Voeg 100 μl gebiotinyleerde werkoplossing voor detectie-antilichamen toe aan elk putje.Bedek met de plaatafdichter.Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder schudden bij 500 rpm.

5. Herhaal de wasstap.

6. Voeg 100 μl HRP-streptavidine-werkoplossing toe aan elk putje.Bedek met de plaatafdichter.Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder schudden bij 500 tpm.

7. Herhaal de wasstap opnieuw.

8. Voeg 100 μl TMB-substraatoplossing toe aan elk putje.Bedek met de plaatafdichter.Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Bescherm tegen licht.De vloeistof wordt blauw door de toevoeging van substraatoplossing.

9. Voeg 50 μl stopoplossing toe aan elk putje.De vloeistof zal geel worden door toevoeging van stopoplossing.Voer vervolgens de microplaatlezer uit en voer onmiddellijk een meting uit bij 450 nm.

Berekening van resultaten

1. Gemiddelde van de dubbele metingen voor elke standaard, controle en monsters en trek de gemiddelde optische dichtheid van de nulstandaard af.Construeer een standaardcurve met absorptie op de verticale (Y)-as en dsRNA-concentratie op de horizontale (X)-as.

2. Het wordt aanbevolen om de berekening uit te voeren met computergebaseerde curve-fittingsoftware zoals curve expert 1.3 of ELISA Calc in een niet-lineair fit-model met 5 of 4 parameters.

Prestatie

1. Gevoeligheid:

onderste detectielimiet: ≤ 0,001 pg/μL (voor UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/μL (voor 5-OMe-UTP-dsRNA).

onderste kwantificeringslimiet:0,0156 pg/μL (voor UTP-, pUTP-dsRNA),0,0312 pg/μL (voor N1-Me-pUTP-dsRNA),0,0625 pg/μL (voor 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Precisie: CV van intra-assay ≤10%, CV van inter-assay ≤10%

3. Herstel: 80%~120%

4. Lineariteit: 0,0156-0,5 pg/μL (voor UTP-, pUTP-dsRNA) 0,0312-1 pg/μL (voor N1-Me-pUTP dsRNA), 0,0625-1 pg/μL (voor 5-OMe-UTP-dsRNA).

Overwegingen

1. TMB-reactietemperatuur en -tijd zijn van cruciaal belang, controleer ze strikt volgens de instructies.

2. Om een ​​goede reproduceerbaarheid en gevoeligheid van de test te bereiken, is het goed wassen van de platen om overtollige niet-gereageerde reagentia te verwijderen essentieel.

3. Alle reagentia moeten vóór gebruik grondig worden gemengd en er kan geen rommel ontstaan ​​tijdens het toevoegen van monsters of reagentia.

4. Als zich kristallen hebben gevormd in de geconcentreerde wasbuffer (20x), verwarm dan tot 37 ℃ en meng voorzichtig totdat de kristallen volledig zijn opgelost.

5. Vermijd het testen van monsters die natriumazide (NaN3) bevatten, omdat dit de HRP-activiteit zou kunnen vernietigen, wat zou resulteren in een onderschatting van de hoeveelheid dsRNA.

6. Vermijd RNase-contaminatie tijdens de test.

7. Het standaard/monster, detectie-antilichaam en SA-HRP kunnen ook bij kamertemperatuur worden uitgevoerd zonder te schudden, maar dit kan ervoor zorgen dat de detectiegevoeligheid met een factor afneemt.In dit geval raden we aan dat de UTP- en pUTP-dsRNA-standaarden worden verdund vanaf 2 pg/μl, de N1-Me-pUTP-dsRNA-standaarden moeten worden verdund vanaf 4 pg/μl en de 5-OMe-UTP dsRNA-standaard moet worden verdund vanaf 8 pg/μl.Incubeer bovendien de HRP-streptavidine-werkoplossing gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.Gebruik geen kolfschudapparaat, omdat een kolfschudapparaat tot onnauwkeurige resultaten kan leiden.

Typisch resultaat

1. Standaardcurvegegevens

2. Standaardcurveberekening

3. Detectiebereik van de voering: 0,0312 - 1 pg/μL