Minikit voor DNA-extractie
Deze kit maakt gebruik van een geoptimaliseerd buffersysteem en silicagelkolomzuiveringstechnologie, waarmee DNA-fragmenten van 70 bp – 20 kb uit verschillende concentraties TAE- of TBE-agarosegel kunnen worden teruggewonnen.DNA-adsorptiekolom kan DNA speciaal adsorberen onder omstandigheden met een hoog zoutgehalte.Bovendien kan de kit direct DNA-fragmenten zuiveren van PCR-producten, enzymatische reactiesystemen of ruwe DNA-producten verkregen met andere methoden, en onzuiverheden zoals eiwitten, andere organische verbindingen, anorganische zoutionen en oligonucleotideprimers verwijderen.Het kan ervoor zorgen dat de zuivering binnen 10-15 minuten kan worden voltooid.Het gezuiverde DNA kan direct worden gebruikt voor ligatie, transformatie, enzymdigestie, in vitro transcriptie, PCR, sequencing, micro-injectie, enz.
Opslag condities
Bewaren bij -15 ~ -25℃ en transporteren bij kamertemperatuur.
Componenten
| Componenten | (100 rxns) |
| Buffer van het bbp | 80 ml |
| Buffer GW | 2 × 20 ml |
| Elutiebuffer | 20 ml |
| FastPure DNA Minikolommen-G | 100 |
Buffer-bbp:DNA-bindende buffer.
Buffer GW:Wasbuffer;voeg vóór gebruik absolute ethanol toe tot het aangegeven volume op de fles.
Elutiebuffer:Elutie.
FastPure DNA Minikolommen-G:DNA-adsorptiekolommen.
Verzamelbuisjes 2 ml:Verzamelbuizen voor filtraat.
Voorbereide materialen
1,5 ml gesteriliseerde buisjes, absolute ethanol en isopropanol (als DNA-fragment ≤100 bp, voeg 1 volume toe
isopropanol op 1 volume gel), waterbad.
Experimenteer proces
Voeg vóór gebruik 80 ml ethanol toe om Buffer GW te verdunnen zoals aangegeven op het etiket en bewaar bij kamertemperatuur.
Mechanisme
1. PCR-reactieoplossing
Gelextractieschema: Voeg een gelijk volume Buffer GDP PCR-reactieoplossing toe, herstelschema:Voeg 5 keer de volumebuffer toe
2. BBP Bereken het gelvolume (100 μl is gelijk aan 100 mg)
Gel oplossen
3. Voorverwarmen op 50 ~ 55℃
4. Bind was
Voeg 300 μl Buffer GDP* toe
Voeg 700 μl buffer GW toe
Voeg 700 μl buffer GW toe
5. Elueer
Voeg 20 – 30 μl elutiebuffer of gedeïoniseerd water toe
Opmerkingen* Terugwinning van PCR-reactievloeistof zonder deze stap
Gel-extractieprogramma
1. Na DNA-elektroforese voor het fractioneren van DNA-fragmenten, snijdt u de enkele strook DNA-fragment uit de agarosegel onder UV-licht.Het wordt aanbevolen om absorberend papier te gebruiken om het zichtbare vocht van de gel te absorberen en de grootte van het gelplakje te minimaliseren door zoveel mogelijk extra agarose te verwijderen.Weeg het gelplakje (zonder microcentrifugebuisje) om het volume ervan te berekenen: Het volume van het gelplakje van 100 mg is ongeveer 100 μl, ervan uitgaande dat de dichtheid 1 g/ml is.
2. Voeg een gelijk volume Buffer GDP toe, incubeer bij 50 ~ 55 ℃ gedurende 7-10 minuten (afhankelijk van de gelgrootte, pas de incubatietijd aan totdat de gel volledig is opgelost).Keer de buis 2 keer om tijdens de incubatie.
Δ Toevoeging van 1-3 volumes Buffer GDP zal de efficiëntie van DNA-herstel niet beïnvloeden.Als het te winnen DNA-fragment <100 bp is, moeten 3 volumes Buffer GDP worden toegevoegd;wanneer de gelplak volledig is opgelost, voeg 1 volume isopropanol toe en meng grondig, ga dan verder met de volgende stap.
3. Centrifugeer kort om het monster naar de bodem van het buisje te brengen, plaats de FastPure DNA Mini Columns-G in de verzamelbuisjes van 2 ml, breng de oplossing van maximaal 700 μL voorzichtig één keer per
tijd naar de filtratiekolommen, centrifugeer bij 12.000 rpm (13.800 X g) gedurende 30-60 sec.
4. Gooi het filtraat weg en voeg 300 μl Buffer GDP toe aan de kolom, incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur, centrifugeer bij 12.000 rpm (13.800 X g) gedurende 30-60 sec.
5. Gooi het filtraat weg en voeg 700 μl Buffer GW (controleer vooraf of absolute ethanol is toegevoegd!) toe aan de kolom, centrifugeer bij 12.000 rpm (13.800 X g) gedurende 30-60 sec.
Δ Voeg Buffer GW toe rond de wand van de adsorptiekolom, of voeg Buffer GW aan de achterkant toe en meng deze 2 – 3 keer ondersteboven om te helpen het zout dat aan de buiswand kleeft volledig weg te spoelen.
6. Herhaal stap 5.
Δ Twee keer spoelen met Buffer GW kan ervoor zorgen dat het zout volledig wordt verwijderd en de impact op volgende experimenten wordt geëlimineerd.
7. Gooi het filtraat weg en centrifugeer de lege kolom gedurende 2 minuten bij 12.000 rpm (13.800 X g).
8. Plaats de kolom in een schoon microcentrifugebuisje van 1,5 ml, voeg 20 - 30 μl elutiebuffer toe aan het midden van het kolommembraan, incubeer gedurende 2 minuten en centrifugeer vervolgens gedurende 1 minuut bij 12.000 rpm (13.800 x g).Gooi de kolom weg en bewaar het verkregen DNA bij -20.
Δ Het overbrengen van de supernatant van stap 8 naar de kolom om opnieuw te elueren en het voorverwarmen van de elutiebuffer tot 55 (wanneer het DNA-fragment >3 kb) kan nuttig zijn om de terugwinningsefficiëntie te verhogen.
Herstelprogramma voor PCR-producten
Dit protocol is van toepassing op het zuiveren van DNA-fragmenten uit PCR-producten, enzymatische reactiesystemen en andere ruwe DNA-producten (inclusief genetisch DNA).Deze oplossing kan op efficiënte wijze verschillende nucleotiden, primers, primerdimeren, zoutmoleculen, enzymen en andere onzuiverheden verwijderen.
1. Centrifugeer PCR-producten, enzymatische reactieoplossingen en andere ruwe DNA-producten kort.Schat het volume ervan met een pipet en breng het over naar een gesteriliseerd buisje van 1,5 ml of 2 ml.Voeg ddH2O toe tot het volume maximaal 100 μl is;terwijl voor genomisch DNA met een hoge concentratie verdunning tot 300 μl met ddH2O de herstelefficiëntie zal helpen verbeteren.
2. Voeg 5 volumes Buffer GDP toe, meng grondig door omkeren of vortexen.Als het DNA-fragment van belang >100 bp is, moeten extra 1,5 volumes (monsters + Buffer GDP) ethanol worden toegevoegd.
3. Plaats de kolom terug in de verzamelbuis, breng het mengsel over naar de kolom en centrifugeer bij 12.000 rpm (13.800 ×g) gedurende 30 – 60 sec.Als het volume van de gemengde oplossing >700 µl is, plaatst u de adsorptiekolom terug in de verzamelbuis, brengt u de resterende oplossing over naar de adsorptiekolom en centrifugeert u bij 12.000 rpm (13.800 x g) gedurende 30 – 60 sec.
4. De volgende prestatie heeft betrekking op stap 5 – 8 van 08-1/Gel-extractieprogramma.
Toepassingen
Verschillende concentraties TAE- of TBE-agarosegel;PCR-producten, enzymatische reactiesystemen of andere ruwe DNA-producten verkregen via verschillende methoden.De gevonden fragmenten varieerden van70bp -20 kb.
Opmerkingen
Alleen voor onderzoeksgebruik.Niet voor gebruik bij diagnostische procedures.
1. Voeg vóór gebruik 80 ml ethanol toe om Buffer GW te verdunnen zoals aangegeven op het etiket en bewaar bij kamertemperatuur.
2. Als de Buffer GDP gemakkelijk neerslaat tijdens opslag bij lage temperatuur, kan deze vóór gebruik een tijdje op kamertemperatuur worden bewaard.Indien nodig kan het worden voorverwarmd in een waterbad van 37 ℃ totdat het neerslag volledig is opgelost, waarna het na het mengen kan worden gebruikt.
3. Stel de waterbadtemperatuur vooraf in op 50 ~ 55℃.
4. In stap 1 van het 08-1/Gel-extractieprogramma zal het minimaliseren van de grootte van het gelplakje de oplostijd aanzienlijk verkorten en de herstelefficiëntie verhogen (gelineariseerd DNA is gemakkelijk te hydrolyseren bij voortdurende blootstelling aan hoge temperaturen).Stel DNA-gel niet langdurig bloot aan UV, aangezien ultraviolet licht DNA-schade kan veroorzaken.
5. Los de gel in stap 2 van 08-1/Gelextractieprogramma volledig op, anders wordt de DNA-herstelefficiëntie ernstig beïnvloed.
6. Verwarm de elutiebuffer of ddH2O tot 55 ℃, wat nuttig is om de efficiëntie van de DNA-elutie te verbeteren.Het wordt aanbevolen om DNA op te slaan in eluens van 2,5 mM Tris-HCl, pH 7,0 – 8,5.
