PNGase F
Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F) is de meest effectieve enzymatische methode voor het verwijderen van bijna alle N-gekoppelde oligosachariden uit glycoproteïnen.PNGase F is een amidase, dat zich splitst tussen de binnenste GlcNAc- en asparagineresiduen van hoge mannose-, hybride en complexe oligosachariden van N-gekoppelde glycoproteïnen.
Sollicitatie
Dit enzym is nuttig voor het verwijderen van koolhydraatresiduen uit eiwitten.
Voorbereiding en specificatie
| Verschijning | Kleurloze vloeistof |
| Eiwitzuiverheid | ≥95% (van SDS-PAGE) |
| Activiteit | ≥500.000 E/ml |
| Exoglycosidase | Er kon geen activiteit worden gedetecteerd (ND) |
| Endoglycosidase F1 | ND |
| Endoglycosidase F2 | ND |
| Endoglycosidase F3 | ND |
| Endoglycosidase H | ND |
| Protease | ND |
Eigenschappen
| EG-nummer | 3.5.1.52(Recombinant van micro-organisme) |
| Moleculair gewicht | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| ISO-elektrisch punt | 8. 14 |
| Optimale pH-waarde | 7,0-8,0 |
| Optimale temperatuur | 65 °C |
| Substraatspecificiteit | Het splitsen van glycosidische bindingen tussen GlcNAc en asparagineresiduen Fig.1 |
| Herkenningssites | N-gekoppelde glycanen tenzij ze α1-3-fucose bevatten Fig. 2 |
| activatoren | DTT |
| Remmer | SDS |
| Bewaar temperatuur | -25 ~-15 ℃ |
| Warmte-inactivatie | Een reactiemengsel van 20 µl dat 1 µl PNGase F bevat, wordt geïnactiveerd door 10 minuten incubatie bij 75 °C. |
Fig. 1 Substraatspecificiteit van PNGase F
Fig. 2 Herkenning zit van PNGase F.
Wanneer de interne GlcNAc-residuen zijn gekoppeld aan al-3-fucose, kan PNGase F de N-gekoppelde oligosachariden niet van glycoproteïnen splitsen.Deze modificatie komt veel voor bij planten en sommige insectenglycoproteïnen.
Ctegenstanders
|
| Componenten | Concentratie |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10×glycoproteïne denaturerende buffer | 1000 µl |
| 3 | 10×Glycobuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Eenheidsdefinitie
Eén eenheid(U) wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om >95% van het koolhydraat uit 10 µg gedenatureerd RNase B te verwijderen in 1 uur bij 37°C in een totaal reactievolume van 10 µL.
Reactieomstandigheden
1. Los 1-20 µg glycoproteïne op met gedeïoniseerd water, voeg 1 µl 10×Glycoproteïne denaturerende buffer en H2O toe (indien nodig) om een totaal reactievolume van 10 µl te verkrijgen.
2.Incubeer gedurende 10 minuten bij 100°C en koel af op ijs.
3.Voeg 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 toe en meng.
4.Voeg 1-2 µl PNGase F en H toe2O (indien nodig) om een totaal reactievolume van 20 µl te maken en te mengen.
5.Incubeer de reactie gedurende 60 minuten bij 37°C.
6.Voor SDS-PAGE-analyse of HPLC-analyse.
