M-MLV omgekeerde transcriptase
RevScript Reverse transcriptase wordt verkregen door middel van genetische manipulatietechnologie.Het heeft een hoger cDNA-synthesevermogen, een hogere thermische stabiliteit en een hogere reactietemperatuurlimiet (tot 60°C).Het gesynthetiseerde cDNA-product is maximaal 10 kb.Het verbetert de affiniteit van de templates en is geschikt voor reverse transcriptie van RNA-templates met complexe secundaire structuur of genen met weinig kopieën.
Componenten
| Onderdeel | HC2003B (10.000U) | HC2003B (5*10.000U) | HC2003B (200.000U) |
| RevScript omgekeerde transcriptase (200U/μL) | 50 μl | 5 × 50 μl | 1 ml |
| 5 × RevScript-buffer | 250 μl | 1,25 ml | 5 ml |
Opslag condities
Dit product moet gedurende 2 jaar bij -25°C~-15°C worden bewaard.
Eenheidsdefinitie
Eén eenheid neemt 1 nmol dTTP op in zuuronoplosbaar materiaal in 10 minuten bij 37°C met behulp van Oligo(dT) als primers.
Reactie-opstelling
1.Denaturatie van RNA-sjabloon (deze stap is optioneel, denaturatie van RNA-sjabloon helpt de secundaire structuren te openen, wat de opbrengst van het cDNA van de eerste streng zal verbeteren.)
| Componenten | Volume (μl) |
| RNase-vrij ddH2O | Tot 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) of Random Primer (50 μmol/L) Of genspecifieke primers (2 μmol/L) | 1 |
| of 1 | |
| of 1 | |
| RNA-sjabloon | X a |
Opmerkingen:
1) a: Totaal RNA: 1-5 ug of mRNA: 1-500 ng
2) Incuberen bij 65°C gedurende 5 minuten, daarna onmiddellijk overbrengen op ijs om gedurende 2 minuten af te koelen.Kort centrifugeren om reactievloeistof te verzamelen, voeg de omgekeerde transcriptiereactieoplossing toe zoals weergegeven in de volgende tabel.Pipetteer voorzichtig om te mengen.
1.Bereiding van het reactiemengsel (20 μl volume)
| Componenten | Volume (μl) |
| Mengsel van vorige stap | 13 |
| 5×Buffer | 4 |
| dNTP-mix (10 nmol/l) | 1 |
| Omgekeerde transcriptase (200 U/μl) | 1 |
| RNase-remmer (40 U/μL) | 1 |
1.Voer de reactie uit onder de volgende omstandigheden:
| Temperatuur (°C) | Tijd |
| 25 °Ca | 5 mins |
| 42 °Cb | 15-30 minuten |
| 85 °Cc | 5 mins |
Opmerkingen:
1) een.Alleen voor het gebruik van de willekeurige hexameren is 5 minuten incuberen bij 25°C vereist.Sla deze stap over als u Oligo (dT) gebruikt18of genspecifieke primer.
2) b.De aanbevolen temperatuur voor omgekeerde transcriptie is 42 °C. Voor sjablonen met gecompliceerde secundaire structuren of een hoog GC-gehalte wordt aanbevolen de reactietemperatuur te verhogen tot 50-55 °C.
3) c.Verwarmen bij 85°C gedurende 5 minuten om reverse transcriptase te inactiveren.
4) Het product kan direct worden gebruikt in PCR- of qPCR-reacties, of worden bewaard bij -20°C voor kortetermijnopslag.Het wordt aanbevolen om de producten uit te delen en bij -80°C te bewaren voor langdurige opslag.Vermijd veelvuldig invriezen en ontdooien.
5) Het product is geschikt voor éénstaps RT-qPCR. Het wordt aanbevolen om 10-20 U reverse transcriptase toe te voegen voor elk reactiesysteem van 25 μL, of de hoeveelheid reverse transcriptase geleidelijk te verhogen afhankelijk van de werkelijke situatie.
Opmerkingen
1.Houd het experimentele gebied schoon;Tijdens het gebruik moeten schone handschoenen en maskers worden gedragen.Alle verbruiksartikelen die in het experiment worden gebruikt, moeten RNase-vrij zijn om RNase-besmetting te voorkomen.
2.Alle procedures moeten op ijs worden uitgevoerd om RNA-afbraak te voorkomen.
3.RNA-monsters van hoge kwaliteit worden aanbevolen om een hoge efficiëntie van omgekeerde transcriptie te garanderen.
4.Dit product is uitsluitend bedoeld voor onderzoeksdoeleinden.
5.Voor uw veiligheid dient u te werken met laboratoriumjassen en wegwerphandschoenen.
