M-MLV Neoscript omgekeerde transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase is een reverse transcriptase die wordt verkregen door mutatiescreening van het M-MLV-gen van oorsprong en expressie van het Moloney muizenleukemievirus in E.coli.Het enzym verwijdert de RNase H-activiteit, heeft een hogere temperatuurtolerantie en is geschikt voor omgekeerde transcriptie bij hoge temperatuur.Daarom is het nuttig voor het elimineren van de ongunstige effecten van de RNA-structuur op hoog niveau en niet-specifieke factoren op de cDNA-synthese, en heeft het een hogere stabiliteit en een hoger vermogen tot reverse transcriptiesynthese.Het enzym heeft een hogere stabiliteit en een vermogen tot reverse transcriptiesynthese.
Componenten
1.200 U/μl Neoscript omgekeerde transcriptase
2.5 × eerste-strengbuffer (optioneel)
* 5 × First-Strand Buffer bevat geen dNTP, voeg dNTP's toe bij het voorbereiden van het reactiesysteem
Aanbevolen toepassing
1.Eénstaps qRT-PCR.
2.Detectie van RNA-virussen.
Opslag condities
-20°C voor langdurige opslag, goed mengen vóór gebruik, veelvuldig invriezen en ontdooien vermijden.
Eenheidsdefinitie
Eén eenheid bevat 1 nmol dTTP in 10 minuten bij 37°C met behulp van poly(A)·oligo(dT)25als sjabloon/primer.
Kwaliteitscontrole
1.SDS-PAGE elektroforetische zuiverheid groter dan 98%.
2.Versterkingsgevoeligheid, batch-tot-batch-controle, stabiliteit.
3.Geen exogene nuclease-activiteit, geen exogene endonuclease- of exonuclease-verontreiniging
Reactie-opstelling voor de eerste kettingreactie-oplossing
1.Bereiding van het reactiemengsel
| Componenten | Volume |
| Oligo(dT)12-18 Primer of willekeurige primerA Of genspecifieke primersb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μl |
| Sjabloon-RNA | Totaal RNA≤ 5μg;mRNA ≤ 1 μg |
| RNase-vrije dH2O | Tot 10 μl |
Opmerkingen:a/b: Selecteer verschillende soorten primers op basis van uw experimentele behoeften.
2.Verwarm op 65°C gedurende 5 minuten en koel snel af op ijs gedurende 2 minuten.
3.Voeg de volgende componenten toe aan het bovenstaande systeem tot een totaal volume van 20 µl en meng voorzichtig:
| Componenten | Volume (μl) |
| 5 × eerste-strengsbuffer | 4 |
| Neoscript omgekeerde transcriptase (200 U/μl) | 1 |
| RNase-remmer (40 U/μL) | 1 |
| RNase-vrije dH2O | Tot 20 μl |
4. Voer de reactie uit volgens de volgende voorwaarden:
(1) Als Random Primer wordt gebruikt, moet de reactie gedurende 10 minuten bij 25 ℃ worden uitgevoerd, en vervolgens gedurende 30 ~ 60 minuten bij 50 ℃;
(2) Als Oligo dT of specifieke primers worden gebruikt, moet de reactie gedurende 30 ~ 60 minuten bij 50 ℃ worden uitgevoerd.
5.Verwarm gedurende 5 minuten op 95 ℃ om Neoscript Reverse Transcriptase te inactiveren en de reactie te beëindigen.
6.Omgekeerde transcriptieproducten kunnen direct worden gebruikt in de PCR-reactie en fluorescentie-kwantitatieve PCR-reactie, of gedurende lange tijd bij -20 ℃ worden bewaard.
PCR Rreactie:
1.Bereiding van het reactiemengsel
| Componenten | Concentratie |
| 10 × PCR-buffer (dNTP vrij, Mg²+ gratis) | 1× |
| dNTP's (10 mM elk dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA-polymerase (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| SjabloonA | ≤10% eerste kettingreactieoplossing (2 μl) |
| ddH2O | Tot 50 μl |
Opmerkingen:a: Als er teveel eerste kettingreactie-oplossing wordt toegevoegd, kan de PCR-reactie worden geremd.
2.PCR-reactieprocedure
| Stap | Temperatuur | Tijd | Cycli |
| Pre-denaturatie | 95℃ | 2-5 minuten | 1 |
| Denaturatie | 95℃ | 10-20 sec | 30-40 |
| Gloeien | 50-60℃ | 10-30 sec | |
| Verlenging | 72℃ | 10-60 sec |
Opmerkingen
1.Geschikt voor optimalisatie van de omgekeerde transcriptietemperatuur in het bereik van 42℃~55℃.
2.Het heeft een betere stabiliteit en is geschikt voor amplificatie van omgekeerde transcriptie bij hoge temperaturen.Bovendien is het gunstig voor het efficiënt passeren van complexe structurele RNA-gebieden.Ook hetis geschikt voor kwantitatieve RT-PCR-detectie in één stap met multiplex fluorescentie.
3.Goede compatibiliteit met verschillende PCR-amplificatie-enzymen en is geschikt voor RT-PCR-reacties met hoge gevoeligheid.
4.Geschikt voor eenstaps fluorescentie-kwantitatieve RT-PCR-reactie met hoge gevoeligheid, verbetert effectief de detectiesnelheid van lage concentraties van sjablonen.
5.Geschikt voor de constructie van cDNA-bibliotheken.
