N-Glycan-kit
Productomschrijving
Dit document geeft informatie over de algemene verzorging en het gebruik van de N-Glycan Kit voor de snelle enzymatische afgifte en snelle labeling van N-glycanen.Dit protocol is gevalideerd met behulp van monoklonale antilichamen en is ook getest op prestaties voor een breed scala aan andere N-gekoppelde glycoproteïnen.We raden de gebruiker aan om de enzymatische afgifte voor zijn specifieke monster te bevestigen.
Componenten
N-Glycaankit (24T)
| Module | Ctegenstander | HCP0031A |
|
Deglycosylatiemodule HCP0031A-1 | IgG | 1,2 mg |
| PNGase F | 45 µl | |
| PNGase F-buffer | 0,5 ml | |
| Oppervlakteactieve stof | 1,2 mg*6 | |
| Etiketteermodule HCP0031A-2 | MS-reagenspoeder | 8,2 mg*3 |
| Watervrij DMF | 1 ml | |
| Opruimmodule HCP0031A-3 | Elutieplaat (96 wells) | 1 stuk |
| Elutiebuffer | 5 ml* 1 | |
| Monsterverdunningsmiddel | 5 ml* 1 | |
|
Monsterverzamelingsmodule HCP0031A-4 | Strips met 8 buisjes (200 μl) | 100 stuks |
| Strips met 8 doppen | 100 stuks | |
| Verzamelplaat (96wells) | 1 stuk | |
| Afvalbak | 1 stuk |
Protocol
De gebruiker moet de onderstaande reagentia en apparaten voorbereiden voordat u begint (één IgG-monster als voorbeeld):
(1) 0,85% Nacl, 100 µl;acetonitril (LC-MS kwaliteit), ultrazuiver water;
(2)15/85=ultrazuiver water/acetonitriloplossing (v/v), 2 ml;1/9/90=mierenzuur/ultrazuiver water/acetonitril (v/v), 20 ml; 50 mM ammoniumformiaat, PH = 4,4, 500 ml;
(3) SPE-vacuümpomp;Negatievedrukprocessor of positievedrukprocessor met 96 putjes;Verwarmingsmodule of metalen bad (90℃ en 50℃);Vortexmixer; pipet.
Stap 1: Snelle deglycosylatie
(1) Verdun het IgG-monster met 0,85% Nacl om een IgG-eindconcentratie van 2 mg/ml te verkrijgen.
(2) PNGase F-buffer: verdun 1 injectieflacon oppervlakteactieve stof (1,2 mg/3,6 mg) met (24 μL/72 μL)) PNGase F-buffer, meng en bewaar bij kamertemperatuur (deze oplossing moet vóór gebruik worden voorbereid).
(3) Voeg 20 μl IgG-oplossing toe aan een reactiebuis van 200 μl, voeg 3 μl PNGase F-buffer toe, pipetteer op en neer om te mengen en voeg vervolgens 3,3 μl ultrapuur water toe, aspireer en doseer om te mengen.
(4) Voeg alle bovenstaande oplossing toe aan de verwarmingsmodule op 90 ℃, 3 minuten, denatureer het en haal het vervolgens uit de verwarmingsmodule en laat het 3 minuten afkoelen bij kamertemperatuur.
(5) Voeg 1,2 μL PNGase F toe, aspireer en doseer om te mengen, verwarm 50 ℃, 5 minuten met verwarmingsmodule.De gebruiker kan tijdens het wachten het etiketteerreagens voorbereiden.
(6) Haal het uit de verwarmingsmodule en laat het vervolgens 3 minuten afkoelen op kamertemperatuur.
Stap 2. Snelle etikettering van glycosylaminen
(1) Etiketteringsreagensoplossing: verdun één injectieflacon met etiketteerreagens (8,2 mg/24,6 m) met watervrij DMF (60,13 μL/180,4 μL), deze oplossing moet vóór gebruik worden bereid), aspireer en doseer 5-10 keer om er zeker van te zijn het reagens is volledig opgelost.
(2) Voeg 6 μl etiketteringsreagensoplossing toe aan het reactiebuisje, aspireer en doseer 5-10 keer om menging te garanderen, en laat vervolgens de etiketteringsreactie in de kamer plaatsvinden.
temperatuur gedurende 5 minuten.
(3) Voeg 179 μl acetonitril toe, meng voor de volgende stap.
Stap 3: Opruimen van Gelabeld Glycosylamijnen
(1) Plaats een onderdrukprocessor of positievedrukprocessor en een elutieplaat met 96 putjes.
(2) Conditioneer putten: voeg 200 μl ultrapuur water toe aan de elutieplaat om de putten te conditioneren, verzamel het afval bij de afvalbak.
(3) Breng de putjes in evenwicht: voeg 200 μl 15/85 water/acetonitriloplossing (v/v) toe om de putjes in evenwicht te brengen, verzamel het afval in de afvalbak.
(4) Monster laden: Laad de met acetonitril verdunde monsters en verzamel het afval in de afvalbak.
(5) Was de putjes tweemaal met 600 μl 1/9/90 mierenzuur/ultrazuiver water/acetonitril (v/v) en verzamel het afval in een afvalbak.
(6) Verwijder de afvalbak en vervang deze door een opvangplaat.
(7) Was de cel met 50 μl elutiebuffer, elueer de glycanen naar de verzamelplaat en herhaal deze stap.
(8) Voeg 200 μl monsterverdunningsmiddel toe en meng het.
Stap 4. HILIC-FLR
(1) Chromatografiekolom: ACQUITY UPLC® Glycan BEH Amide, 130 Å, 1,7 μm, 2,1 x 150 mm (water onderdeelnr. 186004742).
(2) Temperatuur van de kolom: 60 °C
(3) Vloeibare fase A: 50 mM ammoniumformiaatoplossing (LC-MS kwaliteit wordt aanbevolen), pH = 4,4.
(4) Vloeibare fase B: 100% acetonitril (LC-MS kwaliteit isaanbevolen).
(5) Stroomsnelheid: 0,4 ml/min;
(6) Verloop:
| Tijd (min) | Stroomsnelheid (ml/min) | %A | %B | Kromme |
| 0 | 0,4 | 25 | 75 | 6 |
| 35 | 0,4 | 46 | 54 | 6 |
| 36,5 | 0,2 | 100 | 0 | 6 |
| 39,5 | 0,2 | 100 | 0 | 6 |
| 43. 1 | 0,2 | 25 | 75 | 6 |
| 47,6 | 0,4 | 25 | 75 | 6 |
| 55 | 0,4 | 25 | 75 | 6 |
(7)FLR-golflengten: EX 265/EM 425 nm
(8)FLR-bemonsteringsfrequentie: 2 Hz
(9) Injectievolume: 10 μl
Houd er rekening mee dat bovenstaande parameters, gebaseerd op de machine uitgerust met “ACQUITY® RDa”LCMS, de gebruiker de parameter dienovereenkomstig kan aanpassen op andere apparatuur.
Storage
| Reagens | Opslag |
| IgG | 2-8℃, 12 maanden |
| PNGase F | -25 ~ – 15℃℃, 12 maanden, vermijden vries/dooi-cycli |
| PNGase F-buffer | 2-8℃, 12 maanden |
| Oppervlakteactieve stof | Kamertemperatuur, 12 maanden |
| MS-reagens Poeder | 2-8℃, 12 maanden, donker bewaren |
| Watervrij DMF | Kamertemperatuur, 12 maanden |
| Elutiebuffer | Kamertemperatuur, 12 maanden |
| Monster verdunningsmiddel | Kamertemperatuur, 12 maanden |
| Elutieplaat met 96 putjes | Op kamertemperatuur, eenmaal geopend, moet de ongebruikte put worden afgedicht met de plastic paraffinefilm en het droogmiddel op kamertemperatuur bewaren |
| 200μL strips van 8 buisjes, strips van 8 doppen, opvangplaat met 96 putjes, afvalbak | Kamertemperatuur, verzameling met 96 putjes plaat worden afgedicht en droogmiddel op kamertemperatuur bewaren |
Opmerkingen
Draag voor uw veiligheid en gezondheid een laboratoriumjas en handschoenen.
Gebruik elke keer schone tips
Volg de handleiding om de reagentia op te slaan en te gebruiken
